Visión estructural del complejo de transporte intraflagelar IFT

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1506 (2023) Citar este artículo

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Los trenes de transporte intraflagelar (IFT), los polímeros compuestos por dos complejos de múltiples subunidades, IFT-A e IFT-B, llevan a cabo un transporte intracelular bidireccional en los cilios, vital para la biogénesis y señalización de los cilios. IFT-A juega un papel crucial en la importación ciliar de proteínas de membrana y el tráfico de carga retrógrada. Sin embargo, la arquitectura molecular de IFT-A y el mecanismo de ensamblaje de IFT-A en los trenes de IFT in vivo siguen siendo difíciles de alcanzar. Aquí, informamos las estructuras microscópicas crioelectrónicas del complejo IFT-A del protozoo Tetrahymena thermophila. Encontramos que los complejos IFT-A presentan dos estados distintos, alargados y plegados. Sorprendentemente, la comparación con la estructura de tomografía crioelectrónica in situ del tren IFT anterógrado revela una serie de ajustes de los brazos flexibles en apo IFT-A cuando se incorporan al tren anterógrado. Nuestros resultados proporcionan un modelo de resolución atómica para el complejo IFT-A e información valiosa sobre el mecanismo de ensamblaje de los trenes IFT anterógrados.

Los cilios son orgánulos muy conservados que sobresalen de la superficie celular y cumplen una amplia variedad de funciones1. La disfunción de los cilios conduce a numerosas enfermedades humanas llamadas ciliopatías que se asocian con problemas de visión, disfunción renal e infertilidad masculina2. La maquinaria de transporte intraflagelar (IFT) es esencial para el ensamblaje y mantenimiento del cilio, así como para la transducción de señales mediante la entrega de cargas dentro y fuera de los cilios3,4.

Cada tren IFT es un polímero de dos grandes complejos IFT-A e IFT-B con un peso molecular de ~0,8 MDa y 1 MDa, respectivamente5. El complejo IFT-B consta de un subcomplejo central de 10 subunidades IFT-B1 y un subcomplejo periférico de 6 subunidades IFT-B2, que median el tráfico anterógrado (hacia la punta) de proteínas ciliares impulsadas por el motor de microtúbulos kinesin-26,7, 8. El complejo IFT-A está compuesto por seis subunidades (IFT144, IFT140, IFT122, IFT121, IFT139 e IFT43), que intervienen tanto en el tráfico retrógrado (hacia la base) impulsado por la dineína-1b como en la importación ciliar de varias proteínas de membrana a través del puerta ciliar9,10,11,12,13,14. El estudio de tomografía crioelectrónica in situ (crio-ET) del tren anterógrado en Chlamydomonas reinhardtii revela que el tren anterógrado está densamente repleto de IFT-B como la columna vertebral que se encuentra entre IFT-A y el axonema, e IFT-A ubicado directamente debajo de la membrana ciliar15. Después de llegar a la punta ciliar, los trenes anterógrados se remodelan a trenes retrógrados en zigzag completamente distintos, coordinando múltiples eventos que incluyen la inactivación de la quinesina-2, la activación de la dineína-1b y la liberación de cargas15,16,17,18,19,20. Los defectos o la concentración reducida de IFT-A conducen a cilios cortos con velocidades reducidas de transporte retrógrado y la acumulación de IFT-B en la punta ciliar21,22,23,24,25. Las mutaciones en los genes IFT-A causaron una plétora de ciliopatías, incluidas enfermedades relacionadas con el esqueleto, los riñones y los ojos2,26. La falta de estructuras IFT-A de alta resolución dificulta en gran medida nuestra comprensión del mecanismo de ensamblaje de IFT-A en los trenes IFT y de la base molecular del tráfico ciliar y las ciliopatías.

Recientemente, varios estudios informaron estructuras IFT-A de microscopía crioelectrónica (crio-EM) de alta resolución, así como un modelo crio-ET in situ de 20,7 Å del tren IFT anterógrado27,28,29,30. Aquí, purificamos el complejo IFT-A del protozoo Tetrahymena thermophila y determinamos las estructuras crio-EM del complejo IFT-A y sus subensamblajes en un rango de resolución de 3,6 a 8,8 Å. El análisis de estas estructuras revela que el complejo apo IFT-A está compuesto por dos módulos estructurales rígidos, los módulos de cabeza y base, y presenta dos estados distintos: alargado y plegado en soluciones, el último de los cuales no se identificó en IFT-A reciente. estudios estructurales27,28,29,30,31. Además, encontramos que IFT-A se incorpora al tren IFT anterógrado a través de una serie de ajustes de los brazos flexibles en el apo IFT-A. Juntos, nuestros resultados amplían en gran medida nuestra comprensión del mecanismo de ensamblaje de los trenes de IFT y brindan información estructural sobre la patogénesis de las variantes de IFT-A relacionadas con enfermedades en humanos.

Para comprender el mecanismo de ensamblaje del complejo IFT-A, generamos una cepa IFT122-FZZ de Tetrahymena thermophila marcada con carboxilo terminal y proteína A. Se empleó un esquema de purificación por afinidad de dos pasos para enriquecer el complejo Tetrahymena IFT-A endógeno. Luego, el complejo purificado se sometió a SDS-PAGE y análisis de espectrometría de masas, lo que confirmó la presencia de los seis componentes de IFT-A (Fig. 1a, b, Fig. 1a complementaria y Datos complementarios 1). Sorprendentemente, la imagen de PAGE nativo reveló dos bandas difusas separadas de IFT-A, lo que sugiere que este complejo altamente purificado adopta dos conformaciones principales, un estado heterogéneo de migración lenta y otro más homogéneo de migración rápida (Fig. 1b). La clasificación bidimensional de los datos de tinción negativa reveló que las partículas de apo IFT-A son altamente flexibles y adoptan conformaciones alargadas o plegadas, de acuerdo con los estados de migración lenta y rápida capturados por el análisis de PAGE nativo (Fig. 1b-d ).

a Organizaciones de dominio de los componentes IFT-A. IFT144, IFT140, IFT122N, IFT122C, IFT121, IFT139 e IFT43 son de color vara de oro, salmón, verde, amarillo verdoso, turquesa, azul y violeta, respectivamente. Los asteriscos negros indican las hélices insertadas entre la segunda y la tercera repetición de TPR en IFT144, IFT140, IFT122 e IFT121. Los componentes del módulo principal y base tienen colores de fondo amarillo claro y azul pálido, respectivamente. Los modelos de IFT144WD1, IFT144C, IFT140C e IFT139N construidos con la ayuda de AlphaFold-2 se muestran en óvalos o círculos discontinuos. El bucle medio desordenado de IFT43 se muestra en una línea discontinua. b Gel de SDS-PAGE con tinción de plata (izquierda) y gel de PAGE nativo (derecha) que muestran la pureza y las conformaciones principales del complejo IFT-A purificado. Cada experimento se repitió tres veces de forma independiente con resultados similares. c Una imagen de tinción negativa representativa del complejo IFT-A. Dos conformaciones diferentes de las partículas están marcadas con un rectángulo rojo y un círculo, respectivamente. d Promedios de clase 2D de las imágenes de tinción negativa del complejo IFT-A. Mapas de densidad crio-EM del complejo IFT-A alargado (e) y plegado (f) en dos vistas ortogonales. Los módulos de cabeza y base están coloreados en amarillo claro y azul pálido, respectivamente. g Un diagrama esquemático que muestra el cambio conformacional del módulo de la cabeza del estado alargado al plegado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para determinar la estructura crio-EM de Tetrahymena IFT-A, recolectamos 66,729 imágenes de partículas IFT-A sin procesar en hielo vitrificado (Fig. 1b complementaria). La subclasificación nos permitió obtener dos clases distintas de partículas que produjeron los mapas de densidad para el complejo IFT-A alargado y plegado a resoluciones de 8,5 Å y 8,8 Å, respectivamente (Fig. 1e, f y Figs. Suplementarias 2,3) . El análisis comparativo de estos dos mapas reveló que IFT-A está compuesto por dos módulos rígidos con tamaños similares, que de ahora en adelante designaremos como los módulos principal y base de IFT-A (Fig. 1e, f). En el complejo alargado, los módulos principal y base se unen para formar una arquitectura delgada en forma de 'S', que abarca más de 370 Å en la dimensión más larga (Fig. 1e). En marcado contraste, en la conformación plegada, el módulo de la cabeza gira alrededor de 125° como un cuerpo rígido desde su posición en el estado alargado para plegarse sobre el módulo base, ejemplificando la naturaleza dinámica del complejo apo IFT-A (Fig. 1e– gramo).

Para revelar la estructura del complejo IFT-A a nivel atómico, empleamos una clasificación enfocada localmente para mejorar individualmente los mapas de densidad EM de los módulos base y principal, lo que nos permitió construir los modelos de ambos módulos mediante el rastreo de novo con el ayuda de la predicción AlphaFold-2 (Figuras complementarias 2–5 y Tabla 1)32. Excepto IFT43, los cinco componentes grandes de IFT-A contienen una gran variedad de repeticiones de tetratricopéptidos (TPR) que constituyen el esqueleto general del complejo (Fig. 1a y Fig. 6 complementaria). En particular, IFT144, IFT140, IFT122 e IFT121 comparten la misma organización de dominio, desde los terminales N a C que abarcan dos hélices β (WD) WD40 en tándem, una matriz de 12 a 20 TPR y, a excepción de IFT140, un dominio de unión a zinc (ZBD) (Fig. 1a). Estas cuatro subunidades se distribuyen en los dos módulos; el módulo principal consta de IFT140, IFT144 y la mitad del terminal C de IFT122 (IFT122C, 706-1246), mientras que el módulo base consta de IFT121, el terminal N de IFT122 (IFT122N, 1-705), así como IFT139 y IFT43 (Fig. 2a, b). Curiosamente, las hélices N-terminal WD40 junto con los primeros cuatro TPR de IFT140 e IFT144 en el módulo principal están organizados por simetría pseudodoble, en la que una inserción helicoidal α única entre el segundo y el tercer TPR en IFT140 e IFT144 permite que los TPR en la unión se bloqueen en una configuración en zigzag tanto en forma como en formas electrostáticas complementarias (Figs. 1a, 2c y Fig. 7a complementaria). También se encuentra una configuración simétrica pseudo-doble similar en el heterodímero IFT121-IFT122 en el módulo base, lo que subraya la conservación de este mecanismo organizativo básico en ambos módulos de IFT-A (Figs. 1a, 2d y Complementario Fig. 7b). En consonancia con su importancia estructural, las mutaciones únicas sin sentido o las variaciones heterocigotas compuestas en las primeras cuatro TPR de IFT121, IFT122, IFT140 e IFT144 humanos causan múltiples ciliopatías, que incluyen displasia craneoectodérmica, amaurosis congénita de Leber y displasia torácica de costillas cortas33,34,35, 36.

Estructuras atómicas de los módulos cabeza (a) y base (b). Se muestra el esquema de color. La caricatura indica la posición relativa de los módulos en el estado alargado de IFT-A. Los heterodímeros pseudo-dos veces simétricos IFT144-IFT140 (c) e IFT122-IFT121 (d). Las uniones TPR centrales formadas por los primeros cuatro TPR se resaltan en cuadros negros discontinuos, que se amplían a la derecha. Los TPR están numerados y la hélice α insertada en cada subunidad está etiquetada con un asterisco. e Una vista diferente del módulo principal con IFT122 mostrado en la representación de la superficie. f Vistas de primer plano de la red de interacción en el módulo base entre IFT122WD1 e IFT139C (1), entre IFT121WD1 e IFT43 (2), entre IFT121WD2 e IFT43 (3) y entre IFT43 e IFT139-IFT121-IFT122 (4).

A pesar de la organización simétrica pseudo-doble conservada, los módulos de la cabeza y la base muestran características estructurales contrastantes. En el módulo principal, los conectores de ~15 residuos entre la segunda hélice WD40 y el primer TPR tanto en IFT140 como en IFT144 hacen un giro brusco de modo que las hélices de IFT140 e IFT144 apuntan en direcciones opuestas alejándose del pseudodoble central eje en una conformación alargada (Fig. 2a, c). El ZBD del terminal C de IFT122 se conecta al otro lado de la unión TPR IFT140-IFT144 para constituir un núcleo compacto que está rodeado aún más por la matriz TPR de IFT140, enterrando un total de ~2500 Å2 de superficie expuesta al solvente (Fig. 2e ). Desde este núcleo se extienden los brazos TPR de IFT122, IFT140 e IFT144, los segmentos más variables del módulo principal (Fig. 3 complementaria). Una mutación de cambio de marco en Tyr1077 en IFT122ZBD humano (equivalente a Lys1013 en Tetramymena IFT122ZBD) que alteraría el núcleo del módulo de la cabeza provoca el síndrome de Beemer-Langer grave con muerte infantil temprana o displasia craneoectodérmica37, lo que destaca el papel esencial de IFT122ZBD en la organización del núcleo del módulo de la cabeza en IFT-A (Fig. 2e).

En contraste con la conformación alargada del módulo principal, el módulo base adopta una configuración compacta (Fig. 2b). IFT121, IFT122 e IFT139 juntos forman un anillo cerrado de forma ovalada con los TPR de terminal N de IFT139 (IFT139N, 1-694) que se extienden en una conformación de solenoide (Fig. 2b). Los conectores cortos (~5 residuos) entre las hélices WD40 y los TPR en IFT121 e IFT122 restringen las ubicaciones de las hélices justo encima de la unión TPR IFT121-IFT122 para formar la mitad del anillo ovalado (Fig. 2b). Esta conformación se estabiliza mediante amplios contactos entre IFT121 e IFT122, que entierran ~3130 Å2 de área de superficie expuesta al solvente del módulo base (Fig. 2b, d). Por otro lado, el ZBD de IFT121 encaja en un surco helicoidal formado por los TPR de IFT139, constituyendo la otra mitad del anillo base (Fig. 2b). En particular, el anillo oval del módulo base está sellado por el mismo residuo C-terminal de IFT139, Lys1334, cuya cadena lateral alifática se adhiere a la cavidad central hidrofóbica de IFT122WD1 (Fig. 2f). La lisina o arginina altamente conservada de IFT139 en todos los organismos indica un mecanismo de cierre similar para el módulo base de IFT-A (Fig. 6c complementaria).

Una característica destacada del módulo base es que IFT43, la subunidad más pequeña del complejo, adopta una configuración alargada y atraviesa la base como una atadura molecular para estabilizar la arquitectura en forma de anillo (Fig. 2b, f y Fig. 8 complementaria) . El terminal N de IFT43 (IFT43N) viaja a lo largo de la superficie de las dos WD de IFT121 con las cadenas laterales aromáticas de Trp9-Phe11 y Trp33 profundamente incrustadas en los bolsillos hidrofóbicos en IFT121WD1 e IFT121WD2 respectivamente, sujetando las dos hélices en una orientación fija en el módulo base (Fig. 2f). En particular, IFT43N no se observó en las estructuras IFT-A recientemente informadas27,28,29,30. La mitad C-terminal de IFT43 (IFT43C) se pliega en seis hélices separadas (α1-α6) que serpentean a lo largo de la superficie de IFT121 e IFT122, enterrando ~3730 Å2 de superficie accesible al solvente en el módulo base (Fig. 2f). En particular, las hélices α1-α3 llenan el área vacante entre IFT121ZBD e IFT139, mientras que la hélice α4 ocupa un surco profundo formado por IFT122WD2 e IFT121ZBD (Fig. 2f). La pérdida de IFT43 da como resultado la inestabilidad de IFT-A e incluso la pérdida de flagelos14, lo que subraya la importancia de la función de unión molecular de IFT43 en el ensamblaje del módulo base de IFT-A.

Para revelar la relación entre los módulos principal y base en apo IFT-A, ajustamos las estructuras de estos módulos en los mapas de densidad IFT-A alargados y plegados con ajustes manuales para generar los modelos atómicos de todo el complejo IFT-A en ambos estados (Fig. 3a). La comparación estructural muestra que los módulos de cabeza y base individuales son casi idénticos en estos dos estados (Fig. 3a y Fig. 9 complementaria). La diferencia más llamativa entre las estructuras IFT-A alargadas y plegadas proviene de la subunidad IFT122, cuya estructura define cómo se conectan los dos módulos en los dos estados (Fig. 3a, b). En el estado alargado, la matriz TPR de IFT122 comienza desde la unión IFT121-IFT122 en el módulo base y luego se adhiere al núcleo del módulo principal de forma completamente alargada (Fig. 3b). En marcado contraste, la matriz TPR se dobla bruscamente entre las repeticiones cuarta y quinta, de modo que todo el módulo de la cabeza se pliega sobre la base como un cuerpo rígido (Fig. 3b). El ciclo de 11 residuos entre las repeticiones 4 y 5 de TPR de IFT122 (Loop-45, residuos 707–717) que está desordenado tanto en estado alargado como plegado, funciona como una bisagra con alta flexibilidad para acomodar el gran cambio conformacional de IFT-A durante la transición entre los dos estados (Fig. 3b y Fig. 6b complementaria). En particular, en contraste con las ubicaciones periféricas en el estado alargado, los brazos TPR largos de IFT140 e IFT144 están rodeados por los WD de IFT140 y los TPR de IFT121, IFT122 e IFT139 en estado plegado (Fig. 3c). En consecuencia, estos contactos íntimos conducen al enterramiento de ~ 1000 Å2 de área de superficie accesible al solvente entre los módulos principal y base, lo que sugiere que el estado plegado es energéticamente más favorable que el estado alargado (Fig. 3c).

a Los modelos atómicos de los estados alargado (izquierda) y plegado (derecha) de IFT-A. Las proteínas IFT-A tienen el mismo color que la Fig. 1a. El estado plegado se superpone al estado alargado en función de la estructura del módulo base, mientras que su módulo de cabeza está coloreado en gris. b Comparación del brazo TPR de IFT122 en los dos estados. IFT122 está coloreado como la Fig. 1a, mientras que la parte restante de IFT-A está coloreada como la Fig. 1e. Superposición del sitio de flexión de IFT122 en los dos estados. Los primeros cuatro TPR están coloreados en azul pálido, mientras que el quinto TPR y el Loop-45 están coloreados en verde en el estado alargado y en verde claro en el estado doblado, respectivamente. c La interfaz entre los módulos de cabeza y base en estado plegado (izquierda) y alargado (derecha). IFT140TPR e IFT144TPR están coloreados como en la Fig. 1a, IFT139TPR, IFT121TPR, IFT122TPR e IFT140WD como en la Fig. 1e, y el resto de IFT-A en gris claro. d Gráfico de la orientación relativa de la base de la cabeza que muestra dos grupos que corresponden a los estados alargado y plegado, respectivamente. La orientación relativa entre los dos módulos del IFT-A ensamblado en el tren anterógrado se indica mediante un ciclo rojo. Se muestran los movimientos de la cabeza en estado alargado.

Para investigar más a fondo la dinámica de los módulos de cabeza y base en el complejo IFT-A, calculamos el rango de las posiciones relativas entre los dos módulos utilizando las asignaciones angulares de las partículas de las reconstrucciones enfocadas. Este análisis reveló dos clases principales de conformaciones IFT-A con características distintas (Fig. 3d). La primera clase corresponde al estado plegado con una distribución angular estrecha, mientras que la segunda es el estado alargado con una distribución angular más amplia en el que los módulos de la cabeza y la base podrían flexionarse ~30° entre sí (Fig. 3d y Suplementario). Película 1). Proponemos que las conformaciones alargadas y plegadas capturadas por nuestra reconstrucción crio-EM representan dos estados mínimos de energía local del complejo apo IFT en el espacio conformacional en solución acuosa. Por el contrario, solo se identificó la conformación alargada con fluctuaciones locales en otras estructuras IFT-A reportadas recientemente27,28,29,30.

El modelo atómico del complejo apo IFT-A nos brinda una oportunidad única para comprender la base molecular de cómo el complejo IFT-A se incorpora al tren IFT a través de la polimerización. Nos propusimos encajar las estructuras IFT-A en el mapa de densidad crio-ET de 20,7 Å del tren IFT anterógrado del alga verde Chlamydomonas27. Notablemente, encontramos que los núcleos rígidos de la cabeza y la base pueden encajar sin ambigüedades en la densidad del tren anterógrado individualmente con puntajes altos de correlación cruzada de 0.80 y 0.78 respectivamente (Fig. 4a), lo que sugiere que el apo IFT-A existe en un preformado, conformación bimodular antes de la incorporación al tren11,13,14,38.

a Ajuste de IFT-A en el mapa de densidad crio-ET del tren anterógrado. Los núcleos de la cabeza y la base están coloreados en amarillo claro y azul pálido como en la Fig. 1e, y los TPR flexibles en los estados alargados y ensamblados están coloreados en rosa y naranja, respectivamente. b Vistas cercanas de las interacciones entre moléculas formadas entre IFT121ZBD e IFT139N (1), entre IFT140WD e IFT121WD (2), entre IFT144TPR e IFT140TPR (3-4), y entre IFT144ZBD e IFT139N (5). c Ajuste de modelos atómicos de Tetrahymena IFT-A y Chlamydomonas IFT-B en el mapa del tren anterógrado que revela las supuestas interfaces [IFT-A]-[IFT-B]. IFT-A es de este estudio y está coloreado como la Fig. 1a, e IFT-B es de Lacey et al. con IFT172 (residuos 1-1104) coloreados en cian, IFT88 (residuos 122-690) en amarillo, IFT74 (residuos 135-340) en naranja y el resto de IFT-B en marrón claro. El código EMDB del doblete de microtúbulos (MTD) es EMD-20631. Los códigos PDB de IFT-B, dominio motor de dineína-2 y dominio de cola son 8BD7, 6RLA y 6RLB, respectivamente. d Disposición periódica del tren anterógrado. Seis IFT-B, tres IFT-A y dos dineína-1b en una unidad periódica están coloreados como c, mientras que el resto se muestra en gris.

El cálculo de la orientación relativa entre los módulos de cabeza y base de IFT-A en el tren IFT anterógrado reveló claramente que IFT-A en el tren anterógrado es más similar al estado alargado que al plegado (Fig. 3d). El apo IFT-A alargado se puede acoplar en el mapa de densidad crio-ET del tren anterógrado a través de una serie de cambios conformacionales (Fig. 4a y Película complementaria 2). Primero, un ligero ajuste del giro en IFT139N permite que esta estructura de solenoide encaje perfectamente en el volumen vacante en la parte inferior del mapa anterógrado y contacte IFT121ZBD desde el IFT-A vecino (Fig. 4a, b y Fig. 10 complementaria) . Este ajuste de IFT139N polimeriza los complejos IFT-A con un patrón repetitivo [-IFT139N-IFT121ZBD-]n en el tren anterógrado (Fig. 4a, b). Mientras tanto, el núcleo de la cabeza gira ~ 50 ° en sentido antihorario alrededor de la bisagra Loop-45 en IFT122 para encajar en la posición correspondiente en el tren anterógrado, en el que WD1 de IFT140 hace contacto con el vecino WD1 de IFT121 en la posición -1 (Fig. 4a, b). Luego, los brazos TPR flexibles de IFT140 e IFT144 se desenroscan de sus posiciones agrupadas cerca del brazo TPR central de IFT122 para extenderse en direcciones opuestas y asociarse con los brazos TPR de IFT144 e IFT140 de los complejos IFT-A vecinos en el +1 y −1 posiciones, respectivamente (Fig. 4a, b). La iteración de este proceso establece la conexión en tándem de IFT-A en el tren anterógrado en forma de brazo con brazo (Fig. 4a, b). Sorprendentemente, IFT144ZBD en el tren también establece una conexión con IFT139N desde el complejo IFT-A en la posición −2, lo que sugiere que la unidad estructural de IFT-A en el tren anterógrado consta de tres complejos IFT-A interconectados consecutivos (Fig. 4b ). De acuerdo con esta observación, dos mutaciones en IFT144, C1253Y y C1267Y humanos (equivalentes a C1286 y C1300 en Tetrahymena IFT144) que interrumpen la unión del ion zinc conducen a la nefronoftisis y al síndrome de Jeune, lo que subraya el importante papel de IFT144ZBD en la función ciliar39,40. Colectivamente, esta configuración altamente interconectada y polimerizada en el tren anterógrado estabiliza IFT-A en una conformación completamente extendida que, de otro modo, es desfavorable en comparación con los estados apo alargados y plegados de IFT-A (Fig. 4b).

Este modelo reveló dos superficies IFT-A distintas desde la dirección radical en el tren anterógrado. La superficie exterior está enriquecida con WD que lindan con la membrana de los cilios y desempeñan un papel esencial en el suministro de varias proteínas de unión a la membrana (Fig. 4c)9,41,42,43. La superficie interior del otro lado de IFT-A se caracteriza por grupos de TPR de forma convexa de IFT140, IFT144 e IFT139 (Fig. 4c y Fig. 11 complementaria). Para obtener más información sobre las interacciones entre IFT-A e IFT-B en el tren anterógrado, construimos un modelo pseudoatómico acoplando nuestra estructura IFT-A ensamblada y la estructura IFT-B publicada en un mapa compuesto del IFT anterógrado. tren (Fig. 4c)27. El modelo revela tres áreas de contacto putativas entre IFT-A e IFT-B, IFT140IFT-A-IFT172IFT-B, IFT144IFT-A-IFT88IFT-B e IFT139IFT-A-IFT74/IFT81IFT-B (Fig. 4c), que son consistente con estudios bioquímicos previos15,27,29,44,45,46,47. Esta configuración ensamblada de IFT-A en el tren anterógrado está en línea con la noción de que la unidad estructural de los trenes anterógrados está hecha de IFT-A, IFT-B y dineína-1b en una proporción de 3:6:2 (Fig. .4d)15.

Hasta la fecha, hay más de 140 mutaciones sin sentido patógenas en IFT-A registradas en la base de datos de mutaciones genéticas humanas (HGMD, http://www.hgmd.cf.ac.uk/) (Figuras complementarias 6, 12 y datos complementarios). 2). La alta conservación de la secuencia de las proteínas IFT-A entre diferentes organismos nos permite investigar los mecanismos patogénicos de las mutaciones sin sentido en la IFT-A humana (Fig. 5). El análisis estructural del complejo Tetrahymena IFT-A en el tren anterógrado revela que estas mutaciones causantes de enfermedades podrían dividirse en cuatro grupos distintos: mutaciones en las WD de las proteínas IFT-A (tipo I); mutaciones en la interfaz de ensamblaje [IFT-A]-[IFT-A] (tipo II); mutaciones en la interfaz de ensamblaje [IFT-A]-[IFT-B] (tipo III); y mutaciones en la interfaz del componente dentro del complejo IFT-A (tipo IV) (Fig. 5 y Fig. 12 complementaria). Dado que todas las WD de IFT-A miran directamente a la membrana de los cilios, es probable que la mayoría de las mutaciones de tipo I en las WD tengan efectos adversos en el tráfico de carga directa o indirectamente al afectar el plegamiento y/o la estabilidad de las WD (Figs. 4c y 5) . Por el contrario, las mutaciones en las interfaces de tipo II y -III interferirían con la polimerización de IFT-A en el tren IFT anterógrado (Figs. 4c, 5 y Fig. 12 complementaria), mientras que las mutaciones de tipo IV conducirían a la inestabilidad de la IFT. -Complejo A (Figs. 2a, b y 5). En particular, todos los mutantes de tipo III están ubicados en IFT144C o en IFT139N, en línea con la observación de que tanto IFT144 como IFT139 están en la interfaz entre IFT-A e IFT-B (Fig. 12 complementaria). Curiosamente, el IFT139 humano, a pesar de su posición periférica en IFT-A y la falta de WD, es una subunidad que causa enfermedades con frecuencia entre todas las proteínas IFT-A (Fig. 5, Figs. Suplementarias 6, 12 y Datos Suplementarios 2). En particular, las mutaciones que causan el síndrome de Meckel-Gruber (MKS), una enfermedad de anomalía congénita autosómica recesiva letal, solo se encuentran en IFT139 (Fig. 5 y Datos complementarios 2), lo que subraya el papel esencial de IFT139 en la función de los cilios21,38, 48.

Las mutaciones patógenas de IFT-A se pueden dividir en cuatro categorías distintas (tipo I, II, III y IV) en función de sus funciones en la entrega de carga o el montaje de trenes IFT.

En este estudio, determinamos la estructura crio-EM del complejo IFT-A que nos brinda una oportunidad única para comprender la arquitectura de IFT-A, su montaje en los trenes IFT y su papel en el transporte de carga a motor dentro de los cilios. Las proteínas IFT-A se encuentran tanto en los trenes anterógrados y retrógrados como en el citoplasma con la distribución más concentrada en la base de los cilios5,18,49. No ha quedado claro si estos componentes de IFT-A ensamblan el complejo IFT-A en el momento en que se incorporan a los trenes IFT o preensamblan el complejo IFT-A en el citoplasma primero antes de la incorporación a los trenes. La purificación y visualización de los complejos IFT-A endógenos de Tetrahymena que se informan aquí sugieren que es muy probable que el complejo IFT-A exista como un complejo bimodular preensamblado en la base de los cilios (Fig. 1). De manera consistente, en un estudio reciente se mezclaron proteínas IFT-A humanas expresadas recombinantemente para obtener el complejo IFT-A humano cuya estructura, aunque solo parcialmente resuelta a nivel atómico, es similar a la conformación alargada del complejo Tetrahymena IFT-A, lo que respalda la noción de que los componentes IFT-A podrían formar espontáneamente el complejo IFT-A en solución antes de incorporarse a los trenes IFT (Fig. 1)29. Este mecanismo jerárquico altamente eficiente es una característica común para el ensamblaje de biomacromoléculas, un buen ejemplo del cual es el complejo del poro nuclear, cuya formación involucra una jerarquía de pasos de ensamblaje de subcomplejos bien definidos50.

Durante el ensamblaje paso a paso del tren IFT anterógrado en la base ciliar, la matriz IFT-B autopolimerizada primero se adhiere al microtúbulo y luego el complejo IFT-A se incorpora al tren en la columna vertebral del IFT-B frente a los cilios. membrana (fig. 6)31. Se informó que IFT74IFT-B e IFT139IFT-A son necesarios para la asociación entre IFT-A e IFT-B15,47. En consecuencia, el ajuste del modelo de nuestra estructura IFT-A de alta resolución en el mapa de densidad in situ del tren anterógrado del alga verde Chlamydomonas revela que IFT74IFT-B está muy cerca de IFT139IFT-A (Fig. 4c y Fig. 11 complementaria) 15,27. Proponemos que el IFT-A preensamblado inicie el montaje en el andamio IFT-B a través de la interacción entre IFT74IFT-B e IFT139IFT-A, lo que induce el giro de los TPR N-terminales de IFT139IFT-A para permitir que IFT139IFT-A interactúe. con IFT121IFT-A adyacente para polimerizar todos los módulos base IFT-A en el tren (Fig. 4a y Fig. 11 complementaria)27. Además del contacto IFT139IFT-A-IFT74IFT-B en el módulo base IFT-A, el ajuste de IFT-A en el tren anterógrado también revela proximidades espaciales entre IFT88IFT-B e IFT144IFT-A y entre IFT172IFT-B e IFT140IFT-A ( Fig. 4c y Fig. complementaria 11)29,44,45,46. Especulamos que estos dos contactos entre IFT-A e IFT-B acompañan una cascada de eventos para completar la incorporación de IFT-A en el tren anterógrado, incluida la rotación del vástago IFT122, el desenrosque de los brazos TPR de IFT140 e IFT144 así como como el establecimiento de la conexión IFT140-IFT144 entre complejos IFT-A adyacentes en forma de brazo con brazo (Fig. 4b). Se requiere información estructural in situ de mayor resolución del tren IFT anterógrado para verificar aún más este modelo.

Los complejos IFT-A del ensamblaje de subunidades IFT-A recién expresadas y el desensamblaje de trenes IFT retrógrados se concentran en los cuerpos basales. Los IFT-A bimodulares preensamblados se incorporan en el tren IFT anterógrado doblando las regiones de bisagra y torciendo los TPR flexibles. Después de llegar a la punta, IFT-A e IFT-B se disocian del tren anterógrado, probablemente a través de ajustes en las regiones de bisagra y los TPR flexibles para transformar el tren anterógrado en un tren retrógrado en zigzag. Finalmente, los trenes retrógrados regresan a los cuerpos basales y el IFT-A se separa del tren retrógrado para terminar un ciclo. Las preguntas iniciales sobre el mecanismo de giro de la punta ciliar y el ensamblaje del tren retrógrado, así como los roles del complejo IFT-A plegado en el ciclo IFT-A esperan más estudios.

Una vez que alcanzan la punta ciliar, los trenes IFT anterógrados densamente empaquetados se remodelan en trenes retrógrados que adoptan una forma de zigzag suelto en tomografías sin procesar15,16,17,18,19,31,51. ¿Cómo se transforman los mismos complejos IFT-A e IFT-B entre estos dos estados con conformaciones marcadamente distintas? Una característica estructural común y destacada tanto para IFT-A como para IFT-B son sus arquitecturas bimodulares con una región de bisagra flexible en el medio (Fig. 1 y Fig. 11 complementaria)27. Similar a los módulos de cabeza y base de IFT-A, IFT-B consta de dos subcomplejos estables IFT-B1 e IFT-B2 como lo revelan los mapas de densidad crio-ET in situ de 9,9 Å y 11,5 Å, respectivamente (Fig. .11)27. Dada la estabilidad de estos módulos, es poco probable que IFT-A e IFT-B en el tren anterógrado se desensamblen por completo en subunidades individuales antes de volver a ensamblar el tren retrógrado (Fig. 6). En su lugar, proponemos que, con la ayuda de la configuración activa de dineína-1b, IFT-A e IFT-B probablemente hacen que la flexión en las regiones bisagra se combine con giros de los TPR flexibles en las proteínas IFT para transformar el tren anterógrado en el tren retrógrado en zigzag manteniendo las estructuras internas de cada módulo en IFT-A e IFT-B (Fig. 6).

En resumen, los modelos atómicos de alta resolución de IFT-A presentados aquí y por otros revelan conformaciones alargadas muy similares, lo que brinda información valiosa sobre el ensamblaje del tren IFT anterógrado27,28,29,30. Un hallazgo único de nuestro estudio es la identificación del estado plegado de IFT-A que es claramente distinto de las conformaciones de IFT-A alargadas y ensambladas en tren anterógrado. Presumimos que esta conformación plegada es un estado relacionado con IFT-A en el tren retrógrado o representa un estado en la punta ciliar antes del ensamblaje de trenes IFT retrógrados (Fig. 6). Se necesitan futuros estudios estructurales in situ de alta resolución para responder a estas preguntas y comprender los mecanismos de transporte de los trenes IFT anterógrados y retrógrados.

Las cepas de Tetrahymena thermophila B2086, CU428.2 y el plásmido pFZZ-neo4 se adquirieron en Tetrahymena Stock Center (Universidad de Cornell). La etiqueta FZZ en el plásmido se separó mediante un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) entre el péptido Flag (F) y los módulos de dominio de proteína A en tándem (ZZ). Los últimos ~1000 pb de la secuencia codificante de IFT122 y ~1000 pb de la región no traducida (UTR) 3' de IFT122 se amplificaron por separado a partir de ADN genómico de Tetrahymena y se clonaron en el vector pFZZ-neo4. Los cebadores se enumeran de la siguiente manera:

Fw (IFT122) 5'-CGCTCTGAAACAACCTAATAAAAAAAAAAAAAAGCG-3',

Rev (IFT122) 5'-ATCGGATCCGAAATCAAAAACATCCTTCTAAGGTCC-3',

Fw (IFT122 3'UTR) 5'-TCAAGCTTAGCAAAAGCCTACAAATAATTAAAAG-3',

Rev (IFT122 3'UTR) 5'-CCCCTCGAGACACAAGACTTCGCACATAAAATG-3'.

Luego, el fragmento de ADN que abarca IFT122-FZZ-neo4 fue digerido por endonucleasas dobles del vector, inyectado en conjugados de B2086 y CU428.2 por electrotransformación e integrado en el locus IFT122 endógeno. Luego, los exconjugantes se transfirieron a medio Neff fresco y los transformantes se seleccionaron aumentando gradualmente la concentración de paromomicina. Cuando las células no pudieron duplicarse en 24 horas, BD Influx separó las células individuales y las cultivó en medio fresco sin paromomicina durante una semana. Luego extrajimos los ADN genómicos, verificamos los genotipos de las células mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) y elegimos clones con reemplazo total de genes para cultivos a gran escala.

Para la purificación por afinidad, se cultivaron 20 l de células que expresan FZZ-IFT122 en medio Neff a 30 °C hasta la fase logarítmica media (4 × 105 células por ml). A continuación, las células se recogieron y lisaron en un tampón que contenía HEPES 50 mM (pH 7,4), NaCl 50 mM, glicerol al 10 % (v/v), IGEPAL CA-630 al 0,05 % (v/v) y 1 cóctel inhibidor de proteasa (MedChem Expresar). Después de la sonicación y el centrifugado, se recogió el sobrenadante y se incubó con 400 µl de perlas de flujo rápido IgG Sepharose 6 (GE Healthcare) a 4 °C durante 6 horas. Luego, las perlas se lavaron con tampón de lisis y se digirieron durante la noche con la proteasa TEV. El eluato de las perlas de IgG se unió a la resina de afinidad anti-DYKDDDDK G1 (GenScript) durante 2 horas. Después de lavar con tampón de lisis, la proteína del complejo IFT-A se eluyó con 2 mL de 0,2 mg mL−1 de péptido Flag en un tampón que contenía HEPES 50 mM (pH 7,4), NaCl 50 mM e IGEPAL CA al 0,025 % (v/v). -630 y concentrado a 20 µL a 3 mg mL−1. Se realizaron gel de SDS-PAGE con tinción de plata, gel de PAGE nativo y espectrometría de masas para analizar la pureza y homogeneidad del complejo IFT-A.

Las rejillas Cryo-EM se prepararon con el émbolo Vitrobot Mark IV (FEI) ajustado a 8 °C y 100 % de humedad. Se aplicaron 2,5 µl de muestra de proteína en una rejilla de carbono con orificios de malla 300 Au Quantifoil R1.2/1.3 de descarga luminiscente. Inmediatamente después, se aplicaron una fuerza de transferencia de -1 y un tiempo de transferencia de 3 segundos para transferir las cuadrículas. Luego, las muestras en rejillas se vitrificaron mediante congelación por inmersión en etano líquido preenfriado a una temperatura de nitrógeno líquido.

Las rejillas hidratadas congeladas se cargaron en un microscopio electrónico FEI Titan Krios G3i de 300 kV equipado con un detector de electrones directo Gatan K3. Los datos se adquirieron automáticamente con el software EPU (FEI Eindhoven, Países Bajos). Las películas con ganancia normalizada se recopilaron con un aumento de 81 000 en modo de superresolución (tamaño de píxel de 0,55 Å) y en un rango de desenfoque de entre -1,5 y -2,5 μm. La dosis total de 50 e-/Å2 se fraccionó en 32 fotogramas. Para mejorar la resolución, se adquirieron un total de 66.729 pilas de películas para las estructuras presentadas en este trabajo.

MotionCor252 realizó la corrección de movimiento global y local, así como la ponderación de la dosis para cada fotograma de las pilas de películas originales de superresolución. Tanto las micrografías ponderadas por dosis como las no ponderadas se redimensionaron a un tamaño de píxel de 1,1 Å con un factor de agrupación de dos. Las micrografías de dosis ponderada se usaron para la selección de partículas y el procesamiento posterior de datos, y las no ponderadas por dosis se sometieron a la búsqueda de parámetros de función de transferencia de contraste (CTF) en Gctf53. Los valores atípicos de los resultados del preprocesamiento se filtraron manualmente comprobando el movimiento y las cualidades de ajuste de CTF.

Para el primer conjunto de datos, se selecciona manualmente un grupo inicial de ~1000 partículas y se aplica a la clasificación 2D sin referencia en RELION 3.054. Los promedios de clase 2D resultantes se usaron como plantillas para la selección automática de partículas en Gautomatch (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/download/gautomatch-056/). Todas las partículas se normalizaron y agruparon en cuatro durante la extracción con un tamaño de caja de 128 píxeles. Se realizaron varias rondas de trabajos de clasificación 2D para eliminar contaminantes y partículas ruidosas. Luego, las partículas de salida se sometieron a una gran cantidad de trabajos de clasificación 3D con diferentes combinaciones de número de clase y parámetro de regularización T. Todas las partículas correspondientes a los mapas de densidad de resoluciones más altas y niveles de ruido más bajos se fusionaron y se eliminaron los duplicados, y luego se volvieron a colocar. extraído con un tamaño de píxel de 1,1 Å. Los siguientes pasos de procesamiento de alta resolución, incluido el refinamiento enmascarado, la clasificación 3D sin alineación, así como la búsqueda angular local, dan como resultado un mapa de densidad que resultó ser el módulo base de IFT-A con una resolución de 4,8 Å basado en el estándar de oro de Fourier. Criterio de corte de correlación de Shell (FSC) de 0,143. Se iteró una nueva ronda de selección de partículas para todos los conjuntos de datos mediante el uso de proyecciones de este mapa de densidad recién obtenido. El nuevo conjunto de partículas se clasificó en un tamaño de píxel de 4,4 Å, se limpió mediante rondas de clasificación 2D y finalmente se sometió a clasificación 3D con un diámetro de partícula mayor de 320 Å. Como resultado, se obtuvieron todos los mapas de densidad, incluido el módulo base de IFT-A y los complejos completos de IFT-A en estados alargados y plegados. Con la optimización del diámetro de la máscara de partículas, el recentrado de partículas y una mayor clasificación en 3D, las resoluciones generales de los mapas para el módulo base, IFT-A en estado plegado e IFT-A en estado alargado finalmente se mejoraron a 3,6 Å, 8,8 Å y 8,5 Å, respectivamente. Después del pulido bayesiano y el refinamiento CTF, los mapas de densidad del módulo principal se mejoraron a 4,2 Å (trazable IFT1401-1081) y 4,6 Å (trazable IFT140 de longitud completa), respectivamente. Para una mejor visualización del IFT139N flexible (residuos 1–694) en el módulo base e IFT144C (residuos 1130–1387) en el módulo principal, los mapas de densidad base y principal finalmente se resolvieron en 4,7 Å y 6,0 Å, respectivamente, mediante señal sustracción, clasificación sin alineación y búsqueda angular local. ResMap55 estima las variaciones de resolución local.

Combinamos la construcción de modelos de novo y el acoplamiento de cuerpo rígido para generar los modelos atómicos del complejo IFT-A. Para construir manualmente modelos de IFT-A en Coot, nos enfocamos en los residuos únicos con grandes cadenas laterales al principio y al final de cada dominio para la asignación de componentes. Los residuos aromáticos al principio (residuos 1–10) y al final (residuos 331–340) de IFT121WD1 nos permitieron distinguir IFT121 de IFT122. De manera similar, la última hoja β de IFT140WD2 (residuos 705–714) nos permitió distinguir IFT140 de IFT144. La continuidad de los mapas de densidad del módulo base a 3,6 Å y el módulo principal a 4,2 Å nos permitió rastrear sin ambigüedades la mayoría de los residuos de IFT-A. Debido a la flexibilidad, se empleó AlphaFold-2 para asistir en la construcción de modelos para IFT139N (residuos 1–694) del módulo base, IFT144WD1, IFT144C (residuos 1130–1387) e IFT140C (residuos 1082–1407) del módulo principal32. El modelo final de todo el complejo fue refinado iterativamente por PHENIX y validado por MolProbity56,57. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se enumeran en la Tabla 1.

Utilizamos el mapa crio-ET in situ de 20,7 Å de IFT-A depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) y nuestra estructura de IFT-A en estado alargado para construir un modelo pseudoatómico del polímero IFT-A ensamblado27 . Debido a la estabilidad de los núcleos de la cabeza y la base y la flexibilidad de los TPR, primero truncamos los TPR flexibles, incluidos IFT122 (residuos 707–837), IFT139 (residuos 1–766), IFT140 (residuos 1035–1407) e IFT144 ( residuos 966-1387) de la estructura de IFT-A en el estado alargado. Las conformaciones únicas de los núcleos de la cabeza y del módulo base nos permitieron ubicarlos en el mapa crio-ET de IFT-A sin ambigüedades con puntajes altos de correlación cruzada (0,80 y 0,77, respectivamente). Luego, ajustamos manualmente los TPR flexibles sin cambiar sus topologías para adaptarse a la densidad y construimos el modelo estructural del IFT-A ensamblado. Por último, se acoplaron varias copias del modelo IFT-A ensamblado en el mapa IFT-A. Para explorar la red de interacción entre IFT-A e IFT-B, se generó un mapa compuesto del tren IFT anterógrado acoplando IFT-A (a 20,7 Å, EMD-15980) e IFT-B (a 9,9 Å, EMD-15977 ) en un tren IFT de montaje (a 29,9 Å, EMD-15261)27,31. Se colocó microtúbulo (EMD-20631) en referencia a un estudio previo15. Luego, los modelos estructurales del IFT-A ensamblado (este estudio), IFT-B (PDB-8BD7) y dineína-2 humana (PDB-6RLA y 6RLB, dineína-1b en Chlamydomonas reinhardtii) se ajustaron posteriormente en el mapa compuesto para generar un modelo pseudoatómico del tren IFT anterógrado. Las figuras de los mapas de densidad EM y los modelos atómicos se generaron utilizando UCSF ChimeraX y PyMol58.

Para los estados alargados y plegados, se usaron dos grupos de imágenes de partículas para obtener los mapas de densidad correspondientes para calcular la distribución de orientaciones relativas entre los módulos de cabeza y base. Cada grupo de partículas se volvió a centrar y volver a extraer tanto en la cabeza como en la base de acuerdo con los resultados de los refinamientos de consenso anteriores. Al tomar como referencia el mapa del estado alargado que se filtró en paso bajo a 10 Å, se realizaron refinamientos enmascarados en las imágenes de partículas recentradas para reconstruir respectivamente los mapas principal y base. Como resultado, cada partícula se reasignó con dos grupos de ángulos de Euler y luego se obtuvieron las matrices de rotación correspondientes para los mapas de cabeza y base. La matriz de rotación que indica la rotación relativa de la cabeza a la base se calculó mediante la producción de la matriz de rotación de la cabeza y la matriz de rotación inversa de la base. Con base en esta matriz, los ángulos de Euler se obtuvieron en secuencia ZYX. Un estudio anterior también empleó un método de cuantificación similar59. Para el estado del IFT-A ensamblado en el tren anterógrado, las matrices de rotación para la cabeza y la base se generaron utilizando ChimeraX para ajustar las partes correspondientes del modelo del tren anterógrado al mapa de densidad del estado alargado58.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas crio-EM del complejo IFT-A se enviaron al Banco de datos de microscopía electrónica con los números de acceso: EMD-34893 (IFT-A en estado alargado a 8,5 Å), EMD-34894 (IFT-A en estado plegado a 8,8 Å). Å), EMD-34895 (módulo base de IFT-A a 3,6 Å), EMD-34896 (módulo base de IFT-A a 4,7 Å), EMD-34897 (módulo principal de IFT-A a 4,2 Å), EMD- 34898 (módulo principal de IFT-A a 4,6 Å) y EMD-34899 (módulo principal de IFT-A a 6,0 Å), y las coordenadas atómicas se han depositado en el Protein Data Bank con códigos de acceso 8HMC (módulo base de IFT- A a 3,6 Å), 8HMD (módulo base de IFT-A a 4,7 Å), 8HME (módulo principal de IFT-A a 4,2 Å) y 8HMF (módulo principal de IFT-A a 4,6 Å). Los detalles adicionales sobre los conjuntos de datos y los protocolos que respaldan los hallazgos de este estudio estarán disponibles por parte del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos al personal de la Instalación de Microscopía Electrónica y la Instalación de Espectrometría de Masas del Instituto de Medicina de Precisión de Shanghái por brindar apoyo técnico y asistencia durante la recopilación de datos. Agradecemos a Wenyan Huang del Hospital Infantil de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghái, por las comunicaciones sobre las enfermedades IFT-A. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2016YFA0501800 a YM y 2018YFA0107004 y 2018YFC2000102 a ML), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31930063 a ML, 32071189 a JW y 31971137 a CH), el Equipo de Investigación Innovadora de Universidad local de alto nivel en Shanghai (SHSMU-ZLCX20211700 para ML, JW y YM) y la Comisión de Educación Municipal de Shanghai Gaofeng Clinical Medicine Grant Support (20181711 para JW).

Estos autores contribuyeron por igual: Yuanyuan Ma, Jun He.

Noveno Hospital Popular, Escuela de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, 200011, China

Yuanyuan Ma, Jun He, Shaobai Li, Chenhui Huang, Jian Wu y Ming Lei

Instituto de Medicina de Precisión de Shanghái, Shanghái, 200125, China

Yuanyuan Ma, Jun He, Shaobai Li, Chenhui Huang, Jian Wu y Ming Lei

Hospital Renji, Escuela de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái, Shanghái, 200032, China

Deqiang Yao

Laboratorio Estatal Clave de Oncogenes y Genes Relacionados, Escuela de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, 200025, China

ming lei

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ML y JW concibieron el proyecto. YM purificó el complejo IFT-A, preparó especímenes crio-EM y recopiló conjuntos de datos. YM y SL determinaron las estructuras. JH, DY y JW llevaron a cabo la construcción y el refinamiento de modelos. Todos los autores contribuyeron a la interpretación de los datos. JW hizo una contribución importante en la identificación del estado plegado de IFT-A. Y MLYMCH y JH escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Jian Wu o Ming Lei.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Saikat Mukhopadhyay y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Ma, Y., Él, J., Li, S. et al. Visión estructural del complejo de transporte intraflagelar IFT-A y su montaje en el tren IFT anterógrado. Nat Comun 14, 1506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37208-2

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Recibido: 09 Diciembre 2022

Aceptado: 06 marzo 2023

Publicado: 17 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37208-2

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