Utilización de la peroxidasa

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 6953 (2022) Citar este artículo

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Se sintetizaron nanopartículas de plata estabilizadas con polivinilpirrolidona (PV-AgNP) a partir de AgNO3/citrato trisódico y con la ayuda de energía de microondas. Se descubrió que los PV-AgNP sintetizados poseían una actividad imitadora de la peroxidasa real. Esta actividad catalítica puede oxidar el reactivo no fluorescente (o-fenilendiamina) a un producto de reacción de alta fluorescencia (2,3-diaminofenazina). El producto de reacción mostró una emisión de fluorescencia a 563 nm tras la excitación a 420. Entre muchos metales, solo los iones de mercurio (II) pueden inhibir la actividad catalítica de la nanozima PV-AgNP. En consecuencia, la intensidad de fluorescencia del producto de reacción se ha extinguido con éxito. Este efecto de extinción en la intensidad de la fluorescencia fue directamente proporcional a la concentración de mercurio (II). En función de este hallazgo, se ha diseñado un enfoque espectrofluorimétrico simple, rentable y selectivo para la detección de mercurio (II) en muestras de agua. La relación lineal entre la inhibición de la intensidad de la fluorescencia y la concentración de mercurio (II) se encontró en 20–2000 nM con un límite de detección de 8,9 nM.

El mercurio metálico es uno de los metales pesados ​​venenosos más conocidos y ampliamente difundidos debido a sus efectos nocivos al acumularse en el cuerpo humano1. Se distribuye ampliamente en el suelo, la atmósfera y el agua de mar a través de las actividades humanas y los fenómenos naturales, provocando graves consecuencias para la mayoría de los organismos vivos y el medio ambiente2. Las principales fuentes de contaminación por mercurio (II) para aguas superficiales y aguas residuales son la producción de cloro-álcali, papel y pulpa, refinería de petróleo, baterías y procesos de fabricación de pinturas en las industrias3. Debido a su alta afinidad por los grupos tiol que se encuentran en enzimas y proteínas, el mercurio puede acumularse en los tejidos y órganos vitales del cuerpo humano, produciendo sustancias tóxicas y dañinas para la salud humana incluso en cantidades bajas4. Algunos síntomas y signos crónicos y agudos generados por la toxicidad del mercurio inorgánico son los siguientes: inflamación de la boca; sed; sabor metálico; náuseas; salivación excesiva; degeneración renal y temblor5.

La selectividad y la sensibilidad del quimiosensor utilizado para detectar iones de mercurio (II) en muestras de agua es una demanda esencial. Por lo tanto, el sensor utilizado debe caracterizarse por su sencillez, bajo costo, alta sensibilidad y adecuada selectividad, que pueda estar detectando iones de mercurio (II) en muestras acuosas a nivel nanomolar y sin interferencias por la presencia de otros iones metálicos.

Las nanopartículas se aplican ampliamente como sensores para detectar contaminantes ambientales6,7,8,9. Muchos investigadores están interesados ​​en las nanopartículas de plata debido a sus características ópticas inusuales, su banda SPR y su tamaño ultrapequeño10,11,12,13. Las nanopartículas de plata también se emplean ampliamente en las industrias de sensores, textiles y almacenamiento de alimentos debido a su excelente conductividad y actividad catalítica10,11,12,13,14,15. La actividad enzimática distintiva y única de las nanopartículas de metales ha atraído el interés en la catálisis de numerosas reacciones químicas y aplicaciones de análisis de metales16.

Hay muchas ventajas en el uso de nanopartículas como una enzima imitadora/enzima artificial sobre las enzimas naturales que se centran en la ausencia de los obstáculos inherentes a la enzima natural. Estos obstáculos incluyen la disponibilidad de los recursos naturales, que consume mucho tiempo y es tedioso, y el costoso proceso de purificación; sensibilidad a las temperaturas elevadas, condiciones de almacenamiento rigurosas, sensibilidad a las condiciones de pH alcalino y ácido y proteasas, lo que conduce a una menor estabilidad que reduce la vida útil17,18. Las nanopartículas inorgánicas imitadoras de enzimas cuentan con algunas características, que incluyen bajo costo, alta estabilidad, resistencia a las altas concentraciones del sustrato, facilidad de proceso de almacenamiento y facilidad de síntesis19,20,21.

En general, las nanopartículas de metales nobles (como oro, plata, platino y paladio) exhiben características fisicoquímicas atractivas que dependen de su forma y tamaño6,16. Por ejemplo, la actividad catalítica similar a la peroxidasa de las nanopartículas de oro se ha utilizado para la detección colorimétrica de iones de mercurio (II) y plomo en muestras de agua22,23. Además, la actividad catalítica de las nanopartículas de platino se ha utilizado para detectar iones de mercurio (II) en muestras de agua24,25. Además, la actividad catalítica de las nanopartículas de plata se ha empleado para la detección colorimétrica visual de proteínas y como sensor de dispersión Rayleigh de resonancia para la detección de iones de mercurio (II)26,27,28. La actividad catalítica de estos nanomateriales depende de sus tamaños, lo que se conoce como "efecto de tamaño"; por ejemplo, la gran actividad catalítica de las nanopartículas de oro se puede observar con nanotamaños inferiores a 5,0 nm 16,29,30. Por ello, se han dedicado muchos esfuerzos a reducir el tamaño de las nanopartículas sintetizadas31.

Los estudios informados demuestran que el uso de tensioactivo de polivinilpirrolidona para preparar Ag-NP produce nanotamaños diminutos por debajo de 10 nm y estabiliza las nanopartículas formadas durante un período prolongado32,33. Además, la energía de irradiación de microondas sobre el calentamiento convencional provoca un calentamiento uniforme y rápido de la solución. Produce así sitios de nucleación homogéneos en las condiciones de solución y crecimiento, originando nanopartículas monodispersas en poco tiempo34. Además, la irradiación de microondas puede proporcionar una buena distribución del tamaño de partículas y tamaños de partículas más pequeños para sintetizar nanopartículas de plata35.

El espectrómetro de fluorescencia es una técnica analítica de alta sensibilidad que suele ofrecer una gran selectividad sin perder precisión36,37,38. Aún no se ha investigado el diseño de un sensor fluorescente para la detección de iones de mercurio (II) basado en la propiedad similar a la peroxidasa de las nanopartículas de plata. Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo utilizar la actividad catalítica de las nanopartículas de plata estabilizadas con polivinilpirrolidona de menor tamaño como nanozima para la detección de fluorescencia de iones de mercurio (II).

Sigma-Aldrich Chemical Co (Steinheim, Alemania) ha producido O-fenilendiamina, polivinilpirrolidona y nitrato de plata.

El-Nasr Chemical Co. ( El Cairo, Egipto). El citrato trisódico ha sido producido por Fisher Scientific Co. (Leicestershire, Reino Unido). Se utilizó agua ultrapura en todos los pasos experimentales.

Los espectros de fluorescencia se realizaron en un espectrómetro fluorescente FS2 (Scinco, Corea). La morfología de las nanopartículas de plata preparadas ha sido caracterizada por JSM 5400 LV SEM (JEOL, Tokio, Japón). El tamaño nanométrico, el índice de polidispersión y la calidad de las nanopartículas de plata preparadas se han caracterizado por ZEN 1690 (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido). Se utilizó un horno de microondas SM-2000MW (Smart Co., China) para el proceso de calentamiento.

La solución de PVP al 0,2 % p/v, la solución de citrato trisódico 10 mM y la solución de nitrato de plata 10 mM se vertieron simultáneamente en un matraz de 250 ml en una proporción de 0,5:1:1 y se mezclaron mediante agitación magnética durante 3 min. El matraz se ha calentado durante unos 12 min a 90 °C mediante irradiación con microondas. La formación de nanopartículas de polivinilpirrolidona plata (PVP-AgNP) puede evidenciarse mediante la transformación de la solución incolora a un estado coloidal de color verde amarillento.

En una serie de matraces calibrados (10 mL), se vertieron volúmenes adecuados de soluciones de mercurio (II) (en el rango de 100 nM a 20 µM) y 800 µL de solución de PVP-AgNPs, se incubaron durante 2 min y luego se añadió de 800 µL de solución de O-fenilendiamina (preparada disolviendo 0,108 g en 100 mL de agua). Luego, se añadieron al contenido 400 µl de solución de peróxido de hidrógeno al 3 % p/v y el contenido se agitó con vórtex durante 1 min. Después de la incubación durante 15 min a temperatura ambiente, el volumen se completó a 10 ml con agua desionizada. La solución en blanco se ha preparado simultáneamente mediante los mismos pasos omitiendo la adición de solución de mercurio (II). La extinción de la intensidad de fluorescencia de la solución en blanco al agregar mercurio (II) se midió en la \({\lambda }_{emisión}\) de 563 nm, en la \({\lambda }_{excitación}\ ) de 420nm. La especificidad del método sugerido se ha comprobado mediante la adición de diferentes soluciones de iones metálicos a una concentración de 10 µM en lugar de iones de mercurio (II) en los procedimientos mencionados anteriormente.

Las muestras de agua del grifo y agua embotellada se recolectaron de nuestro laboratorio y de un establecimiento local. Las muestras recolectadas se enriquecieron con diferentes concentraciones conocidas de mercurio (II). Luego, las muestras de agua se filtraron utilizando un filtro de jeringa de 0,45 μm para descartar cualquier material particulado. Finalmente, se siguió el ensayo analítico general mencionado anteriormente.

La morfología y las características elementales [tamaño de partícula, índice de polidispersión (PDI), tamaño uniforme] de las PVP-AgNP se examinaron utilizando un dispositivo SEM y un dispositivo zeta-sizer, respectivamente. La Figura 1 muestra la imagen SEM de PVP-AgNPs, que se refiere a la forma de varilla esférica del nanomaterial sintetizado. El tamaño medido de las PVP-AgNP sintetizadas fue de 5,5 nm con tamaño uniforme, buena calidad y un valor de índice de polidispersidad bajo de 0,440 Fig. 1A. El tamaño de las nanopartículas es el principal factor responsable de su actividad catalítica39. Generalmente, el desempeño catalítico de las nanopartículas de plata es inversamente proporcional al tamaño nanométrico de sus partículas40. En el estudio actual, el tamaño determinado de las PVP-AgNP preparadas es muy pequeño (5,5 nm), lo que se refiere a su actividad catalítica superior.

(A) Tamaño de caracterización, valor de PdI y calidad de los PVP Ag-NP sintetizados por dispositivo zeta-sizer; (B) Caracterización de la morfología de los PVP Ag-NP sintetizados por dispositivo SEM.

La O-fenilendiamina (OPD) es uno de los sustratos típicos utilizados para investigar la actividad similar a la peroxidasa de las nanopartículas25,41. La OPD (incolora y no fluorescente) ha sido oxidada por la actividad imitadora de la peroxidasa de ciertas nanopartículas a 2,3-fenazinadiamina (coloreada y fluorescente)25. En este documento, la actividad de imitación de la peroxidasa de las PVP-AgNP preparadas se ha examinado mediante la técnica de fluorescencia y la técnica espectrofotométrica utilizando el sistema OPD/H2O2. En la práctica, la actividad catalítica de las PVP-AgNP preparadas ha sido confirmada espectrofotométricamente por la aparición del pico de absorbancia característico en λmax = 420 nm, Fig. 2. Además, ha sido evidenciada fluorométricamente por la existencia de un pico de fluorescencia distinto en λemisión = 563 tras la excitación λ = 420, Fig. 2. Además, se encontró que solo la mezcla de PVP-AgNPs/OPD/H2O2 exhibió este comportamiento de fluorescencia. Por el contrario, ninguna de las mezclas de PVP-AgNPs/OPD, OPD/H2O2 y PVP-AgNPs/H2O2 ha producido ningún carácter de fluorescencia en las mismas condiciones. Estos valores máximos de absorbancia y emisión de fluorescencia coinciden con los de 2,3-fenazinadiamina informados en estudios de la literatura25.

Examen de la actividad de imitación de la peroxidasa para las PVP-Ag-NP preparadas formando los espectros de absorción y fluorescencia (excitación/emisión) caracterizados del producto de reacción OPDA (2,3-fenazinadiamina).

Es bien sabido que la 2,3-fenazindiamina coloreada, que posee un comportamiento fluorescente distintivo a λemisión = 563 nm/λexcitación = 420 nm, es el producto oxidado de o-fenilendiamina. Inicialmente, la solución incolora cambió de no fluorescente a una solución amarilla fluorescente brillante cuando se añadieron las PVP-AgNP al sistema de o-fenilendiamina/H2O2. En esta reacción, las PVP-AgNP preparadas poseían actividad imitadora de peroxidasa que puede catalizar la oxidación de o-fenilendiamina con H2O2 para producir 2,3-fenazindiamina como producto de reacción principal.

Mercurio tiene una ventaja única sobre el resto de los elementos por su capacidad de formar una amalgama con ciertos elementos como el oro, el platino y la plata24,25,27,28,42,43. Por lo tanto, en este estudio, la formación de amalgama de Ag-Hg produce una inhibición efectiva de la actividad catalítica de las PVP-AgNP, combinada con el cambio de sus propiedades superficiales. Este efecto de inhibición catalítica de las PVP-AgNP impide la transformación del sistema OPD/H2O2 en 2,3-fenazinadiamina. En consecuencia, una acción de extinción de la intensidad de fluorescencia de la solución al agregar mercurio (II) en comparación con la intensidad de fluorescencia de la muestra en blanco (sin Hg2+), Fig. 3. Por lo tanto, la determinación selectiva de mercurio (II) en un se logró cierto rango de concentración lineal. El mecanismo de detección del mercurio (II) se ilustra en el Esquema 1.

(A) para espectros de fluorescencia (excitación y emisión) del sistema OPD/H2O2/PVP-Ag-NPs (a, b, respectivamente) y después de su extinción con 1,0 µM de Hg2+ (c, d), mientras que (B) para fluorescencia espectros del sistema OPD/H2O2/PVP-Ag-NPs en presencia de varias concentraciones de Hg2+.

Elucidación esquemática para la detección de mercurio (II) por técnica espectrofluorimétrica.

Se examinaron y optimizaron las condiciones de reacción relacionadas con el volumen de H2O2, el tiempo de reacción, el volumen de OPDA y el volumen de PVP-Ag-NP para encontrar las condiciones óptimas para el análisis. El sistema de detección se incubó con mercurio (II) durante 15 min y se obtuvieron las condiciones óptimas para la extinción de la intensidad de fluorescencia de la solución (en comparación con la solución en blanco) con 800 µL de suspensión de PVP-AgNPs, 800 µL de OPD solución y 400 µL de solución de peróxido de hidrógeno al 3% p/v, Fig. 4. Este efecto de extinción en la intensidad de fluorescencia de la solución es directamente proporcional a la concentración de mercurio (II).

Investigar el volumen de reactivos para la detección de Hg2+ (1,0 µM) mediante el método sugerido.

La relación lineal entre la extinción de la emisión de fluorescencia a 563 nm y la concentración de mercurio (II) se estableció en el rango de 20 nM a 2 μM con la ecuación de regresión de \(y=0.1352x +13.51\), valor R2 de 0.998, y valor LOD de 8,9 nM (S/N = 3, donde N representa ruido y S representa sensibilidad). Los parámetros estadísticos para detectar Hg2+ mediante la metodología de fluorescencia se presentan en la Tabla 1. Otros metales comunes como Al3+, Ba2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, K+, Mg2+, Ni2+, Na+ y Zn2+ han sido probados por la corriente fluorescente actual. metodología para investigar la selectividad del sistema sensor de diseño. Se encontró que no hay un efecto obvio en la intensidad de emisión del sistema PVP-AgNPs/OPD/H2O2 al agregar cualquier metal de los metales mencionados a un nivel de concentración más alto (exceso de diez veces en comparación con el mercurio (II)). Por el contrario, la intensidad de emisión de PVP-AgNPs/OPD/H2O2 ha disminuido significativamente en presencia de mercurio (II), lo que se refiere a la buena selectividad del sistema fabricado (Fig. 5). La explicación de la perfecta selectividad del método propuesto para el mercurio (II) puede atribuirse a la formación de amalgama de Ag-Hg a través de una interacción específica entre las nanopartículas de plata y el ion de mercurio (II)42.

Examinar la selectividad del sistema utilizado (OPD + H2O2 + PVP-Ag-NPs) para la detección de ion Hg2+ (1 µM) en presencia de iones de metales comunes (10 µM).

Las aplicaciones de PVP-AgNP para experimentos con muestras enriquecidas se realizaron con muestras de agua del grifo y muestras de agua embotellada. Para evaluar la practicidad de aplicar la metodología fluorescente en muestras de agua del grifo y muestras de agua embotellada, se enriquecieron con mercurio (II) a diferentes niveles de concentración y se probaron con la metodología sugerida. Los datos de la Tabla 2 se refieren a la buena recuperación y los valores SD para determinar los iones de mercurio (II) por el método actual. Estos valores de SD y recuperación evidenciaron la validez de la exactitud y precisión de la metodología presentada para la detección de mercurio (II) en muestras de agua del grifo y muestras de agua embotellada.

En este estudio, la energía de irradiación de microondas se utilizó para ayudar a la síntesis de nanopartículas de plata estabilizadas con polivinilpirrolidona con nanotamaños muy pequeños. Las nanopartículas de plata preparadas mostraron un comportamiento distintivo de actividad de peroxidasa. Basado en el efecto de inhibición de los iones de mercurio (II) hacia esta actividad peroxidasa de las nanopartículas de plata preparadas, se estableció una metodología fluorescente con una respuesta altamente sensible y extremadamente selectiva hacia la detección de iones de mercurio (II). En condiciones óptimas, el ensayo proporcionado mostró un límite de detección (LOD) de 8,9 nM con un rango lineal de 20 a 2000 nM. La metodología actual ofreció algunas ventajas en cuanto a la verdor de la síntesis, tamaño de partícula diminuto, buena estabilidad y uniformidad, utilizando menor concentración de la nanozima y facilidad de detección.

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Departamento de Química Analítica Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad Al-Azhar, Sucursal de Assiut, Assiut, 71524, Egipto

Mohamed A. Abdel-Lateef

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El manuscrito fue preparado por MA-L.

Correspondencia a Mohamed A. Abdel-Lateef.

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Abdel-Lateef, MA Utilización de la actividad similar a la peroxidasa de la nanozima de nanopartículas de plata en el sistema O-fenilendiamina/H2O2 para la detección de fluorescencia de iones de mercurio (II). Informe científico 12, 6953 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10779-8

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Recibido: 18 enero 2022

Aceptado: 11 de abril de 2022

Publicado: 28 abril 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10779-8

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