Albúmina de suero bovino

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12336 (2022) Citar este artículo

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El grafeno y su familia tienen un gran potencial en la ingeniería de tejidos debido a sus propiedades supermecánicas, conductividad eléctrica y propiedades antibacterianas. Si se tienen en cuenta otras propiedades del grafeno, como la alta área superficial y la funcionalización lista para usar de acuerdo con los grupos con alto contenido de oxígeno en la familia del óxido de grafeno, se podrían abordar algunas necesidades en la ingeniería de tejido óseo. En este documento, sintetizamos y decoramos nanopartículas de estroncio (SrNP) durante el proceso de reducción de óxido de grafeno utilizando un método verde y novedoso. Sin usar hidracina o enlazadores químicos, las NP de estroncio se sintetizaron y decoraron en la superficie de rGO simultáneamente usando BSA. Los resultados de la espectroscopia UV-Vis, FTIR y Raman demostraron que la BSA podía reducir con éxito el óxido de grafeno y las SrNP decoradas en la superficie de rGO. FESEM y TEM mostraron que las SrNP sintetizadas in situ tenían un diámetro de 25 a 30 nm. Curiosamente, la viabilidad celular para las células MC3T3-E1 tratadas con SrNPs-rGO fue significativamente mayor que BSA-rGO y GO en concentración constante. Además, investigamos la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) de estas nanoláminas y los resultados demostraron que Sr-BSA-rGO mejoró la actividad de ALP más que GO y BSA-rGO. Sorprendentemente, la expresión relativa de los genes RUNX 2 y Col1 de las células MC3T3-E1 aumentó cuando se trataron con nanoláminas Sr-BSA-rGO. Este estudio reveló que el uso de proteínas y otras biomoléculas como agente verde y fácil para la decoración de nanopartículas inteligentes en la superficie de las nanoláminas sería prometedor y ayudaría a los investigadores a reemplazar los materiales duros y tóxicos similares a la hidracina con un método ecológico. Estos resultados demostraron que Sr-BSA-rGO tenía una excelente capacidad para regenerar tejido óseo y podía utilizarse como potenciador de la osteogénesis en implantes.

El hueso es uno de los tejidos más críticos del cuerpo, porque sirve como base para el soporte mecánico, la protección de los órganos y la continuidad del esqueleto. El daño a la integridad estructural del hueso puede ocurrir por varias causas, incluyendo trauma, cirugía, tumores y osteoporosis1. En la mayoría de los casos, el hueso tiene una capacidad significativa para regenerarse y repararse a sí mismo. Sin embargo, hay ciertas situaciones en las que la regeneración completa del tejido óseo no es factible y necesita una mayor estimulación2. Los biomateriales son una alternativa viable a los trasplantes óseos en la ingeniería de tejido óseo3,4. La hidroxiapatita sintética, el fosfato tricálcico, otras biocerámicas, los andamios poliméricos y los implantes metálicos son ejemplos de biomateriales ampliamente utilizados en la ingeniería de huesos y tejidos duros4. Los avances en nanotecnología han transformado la investigación nanomédica en ciencia clínica, dando como resultado nuevos nanodispositivos y nanosistemas que se basan en el diseño y la perfecta integración de nanomateriales funcionales. Los derivados de la familia del grafeno han recibido mucho interés en aplicaciones biomédicas entre muchos nanobiomateriales sintéticos5,6. Una versión hidrofílica de la hoja de grafeno con átomos de carbono hibridados sp2, conocida como óxido de grafeno (GO), ha surgido como una aplicación biomédica prometedora7. La forma reducida de óxido de grafeno, que tiene una toxicidad, biocompatibilidad y sitios de reacción mínimos, puede utilizarse para estimular las actividades celulares y aumentar la capacidad osteogénica del tejido óseo8,9,10. Las propiedades terapéuticas ortopédicas del estroncio (Sr) han generado interés en este contexto11. Los tejidos duros humanos pueden acumular Sr, lo que puede desplazar el calcio de la fase de apatita del mineral óseo. Sr también se asocia con un aumento en la resistencia a la compresión ósea, mientras que su escasez se asocia con consecuencias negativas en los tejidos duros. Los estudios in vitro e in vivo han demostrado que los iones Sr estimulan la formación ósea e inhiben la resorción ósea, lo que los convierte en un agente potencial para el tratamiento de la osteoporosis12. Las propiedades del Sr lo han convertido en un ingrediente popular en vidrios bioactivos y biocerámicos debido a sus ventajas13. El Sr se ha utilizado en aplicaciones de remodelación ósea debido a su similitud estructural y físico-química con los iones de calcio (Ca2+). Por ejemplo, se ha investigado la incorporación de Sr en implantes de fosfato de calcio y titanio para mejorar las propiedades de formación de hueso de estos materiales14. Debido a la gran superficie de las nanoláminas de grafeno, recientemente, los investigadores sintetizaron SrNP en la superficie del grafeno mediante la co-reducción de GO y Sr15. La hidracina como agente reductor se usó para reducir y eliminar las SrNP en la superficie de rGO informadas por Kumar et al.16. Recientemente, Qi et al. nanoláminas rGO decoradas con Sr sintetizadas utilizando hidracina incorporada en la poli(L-lactida) (PLLA) para la fabricación de andamios 3D. La inducción de osteogénesis en Sr-rGO se superó a los andamios rGO y PLLA puros15. Sin embargo, estos estudios demostraron la alta capacidad de las nanoláminas Sr-rGO para la ingeniería de tejido óseo, porque la mejora de la resistencia del grafeno y las propiedades de la osteogénesis Sr utilizando hidracina en el proceso de síntesis planteaba grandes preocupaciones. Primero, la solubilidad en agua de las nanoláminas rGO ha disminuido significativamente, lo que causó dificultades en el proceso de fabricación del compuesto a base de grafeno. En segundo lugar, la hidracina fue un reactivo tóxico que afectó la salud del usuario durante el experimento17. Se han realizado muchos esfuerzos para introducir un reductor ecológico y seguro para superar esta limitación de la hidracina. Por ejemplo, proteínas como la albúmina de suero bovino (BSA) y el ácido ascórbico son reductores seguros para GO3,18,19.

Las proteínas son biopolímeros complejos con segmentos hidrofóbicos e hidrofílicos, que pueden servir como adhesivo para superficies sólidas20. BSA es una proteína de forma esférica que tiene 583 residuos de aminoácidos21. En la estructura de BSA, hay residuos de tirosina que lo distinguen como un agente reductor distinto20. Las secciones hidrofóbicas de BSA pueden adsorberse al área superficial hidrofóbica, mientras que las partes hidrofílicas de BSA podrían interactuar con grupos funcionales de agua en presencia de oxígeno22.

En este estudio, se sintetizaron nanoláminas de Sr decoradas con grafeno mediante la co-reducción de GO y nitrato de estroncio en presencia de BSA, denominado Sr-BSA-rGO. El proceso de síntesis se ilustra en la Fig. 1. En Sr-BSA-rGO, las SrNP se han ubicado en las superficies de las nanoláminas rGO, y en estrecha colaboración con BSA que actúa como un obstáculo estérico para bloquear el re-apilamiento de las nanoláminas rGO después de la reducción. Luego, se estudió la presencia de SrNPs en la superficie de rGO utilizando diferentes métodos. A continuación, se utilizó la línea celular de osteoblastos para investigar el efecto del Sr decorado con BSA-rGO sobre la proliferación. También se llevó a cabo la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP), que es un factor importante en la ingeniería del tejido óseo. Finalmente, la expresión de los genes COL1 y RUNX2 se reveló mediante PCR en tiempo real.

Nanoláminas Sr-BSA-rGO en ingeniería de tejido óseo. Esta ilustración demuestra el proceso de síntesis y aplicación del laboratorio de química al laboratorio de genética molecular, que se empleó en este estudio.

Grafito, KMnO4, ácido sulfúrico (H2SO4) se adquirieron de Merck. BSA, nitrato de estroncio (SrNO3) se adquirieron de Sigma. Todos los reactivos se usaron sin purificación.

De acuerdo con la técnica de Hummer modificada, el polvo de óxido de grafeno se produjo mediante la oxidación química del grafito negro en un entorno de laboratorio. En este método, se expuso 1 g de grafito a 23,3 ml de H2SO4 en un baño de hielo, el cual se insertó entre el medio ácido. El agente de oxidación reemplazó la inserción de ácido para producir el óxido de grafito prístino. Para generar óxido de grafito puro (PGO), se utilizó KMnO4 como oxidante y se adicionó progresivamente de 5 a 15 °C23. Se llevó a cabo una purificación de impurezas para convertir el grafito en óxido de grafito (GO). Se usó hidrólisis de PGO para eliminar el contaminante de sulfato restante. Para eliminar el sulfato covalente de PGO, se añadieron 150 ml de agua destilada y la temperatura se elevó a 90 °C en condiciones de agitación en 30 min, y el sistema se diluyó de nuevo con 500 ml de agua destilada. Por ejemplo, se añadió gota a gota instantáneamente peróxido de hidrógeno (H2O2) para sustraer el KMnO4 sin reaccionar que cambió el color a marrón oscuro24. La solución de óxido de grafito se filtró y se lavó con HCl diluido y etanol en la centrífuga a 8000 rpm y se secó a temperatura ambiente. Se realizó un proceso ultrasónico para exfoliar las nanoláminas GO. El polvo de óxido de grafito se dispersó en agua desionizada (10 mg/ml), y posteriormente se sonicó a una potencia de 30 w durante 3 h (nótese que la temperatura de la solución debe ser de 4 °C usando un baño de hielo).

Utilizamos BSA como agente reductor ecológico y biopegamento para unir Sr a la superficie GO. Inicialmente, se dispersaron 0,5 g de GO en agua desionizada (200 ml) usando ultrasonido, para exfoliar la capa de GO en agua. Se añadieron 2,5 g de BSA a la solución de GO exfoliada en condiciones de agitación. Para hacer una reacción entre BSA y GO, el pH de la solución aumentó a 11,5 agregando gota a gota NaOH 1 M. La mezcla GO-BSA se combinó durante 24 h y las impurezas solubles se separaron mediante centrifugación con etanol. Para la producción de Sr-BSA-rGO, el nitrato de estroncio se combinó con GO en diferentes concentraciones (5, 10, 20% en peso de GO). Brevemente, BSA-rGO se dispersó y sonicó en agua desionizada durante 1 h (potencia: 30 W). Luego, se agregó nitrato de estroncio a la solución de rGO y se agitó durante 2 h para obtener una mezcla homogénea. A continuación, la mezcla se lavó con etanol.

Este estudio utilizó análisis de difracción de rayos X en los polvos producidos utilizando un difractómetro PHILIPS-PW1730 con radiación Cu-K, para determinar la fase y la cristalinidad. Las características microestructurales de las nanoláminas generadas se investigaron utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FESEM, Hitachi S-3400 N, voltaje de 20 kV) y un microscopio electrónico de transición (TEM, Philips, CM300). La espectroscopia Raman se realizó utilizando TakRam N1-541, Teksan Co, Irán. Los espectros FTIR se registraron utilizando TENSOR 27 Brucker.

Utilizamos la línea celular MC3T3-E1 tomada del Banco Celular Nacional de Irán (NCBI) en el Instituto Pasteur de Irán (IPI). Se permitió que las células crecieran en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) a pH neutro (7,2–7,4), que se complementó con un 10 % (v/v) de suero bovino fetal inactivado por calor (50 °C, 30 min). 10% v/v), L-glutamina 2 mM, 100 unidades/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina a 37 °C y 5% de CO2 en incubadora humidificada. Luego, las células se tripsinizaron (0,025 % de tripsina, 0,02 % de EDTA) después de que crecieran hasta un 70-80 % de confluencia. Antes de los tratamientos, se permitió que las células se volvieran a unir al fondo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos durante la noche.

El efecto de los tratamientos con Sr-BSA-rGO, BSA-rGO (denominado rGO en los gráficos) y GO sobre la viabilidad de las células MC3T3-E1 se determinó utilizando el 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 -ensayo de bromuro de difeniltetrazolio (MTT) en cada tiempo de tratamiento deseado. Se prepararon soluciones de trabajo (1, 10, 50 y 100 μg/ml) de nanoláminas de Sr-BSA-rGO en medio DMEM con 1 mg/ml de solución madre (dispersos en medio DMEM). También utilizamos la solución de nanoláminas GO y BSA-rGO (concentración de 100 μg/ml) para estudiar el efecto de las nanopartículas de Sr. Después del tratamiento, las placas se incubaron durante 24, 72 y 120 h para estudiar el efecto de diferentes tiempos de incubación sobre la viabilidad celular. En cada punto de tiempo, se añadieron 20 µl de solución de MTT (5 mg/ml) a cada pocillo de cultivo celular (volumen de medio: 200 µl). La placa se incubó a 37 °C durante 4 h. Después de la incubación, la solución anterior se eliminó lentamente y luego se agregaron 100 μl de solución de DMSO a cada pocillo. Las placas de cultivo celular se devolvieron a la incubadora durante 1 h. La absorbancia se midió a 570 nm utilizando un lector de placas BioTek.

La ALP es uno de los factores que más deben medirse en la ingeniería de tejido óseo. Después de medir la viabilidad de las células tratadas con nanoláminas Sr-BSA-rGO, BSA-rGO y GO en diferentes tiempos de incubación, seleccionamos la concentración más alta de Sr-BSA-rGO (100 μg/ml) y la concentración constante de BSA-rGO y GO nanosheets (100 μg/ml) para estudiar la actividad ALP de las células MC3T3-E1. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos (100 × 103 células por pocillo) y se incubaron durante la noche para que se adhirieran a la superficie de la placa. A continuación, los medios fueron reemplazados por soluciones de trabajo de nanoláminas y recolectadas en la incubadora. Se utilizó el kit ALP (Pars Azmun, Irán) para el experimento de acuerdo con el protocolo de fabricación. Se registró la absorbancia de los pocillos utilizando un lector de placas de 405 nm.

Se examinó la expresión génica relacionada con la osteogénesis para investigar el potencial de diferenciación osteogénica de las células cultivadas en muestras tratadas con Sr-BSA-rGO. En resumen, las células se recogieron a una densidad de 104 células por pocillo en una placa de seis pocillos y se cultivaron durante la noche. A continuación, las nanoláminas de Sr-BSA-rGO se mezclaron en medios de cultivo (100 μg/ml) y se cultivaron durante 1, 3 y 5 días, y los pocillos se consideraron como control (sin nanoláminas). A continuación, las células se lavaron tres veces con una solución de PBS antes de digerirlas con tripsina al 0,25 por ciento. El ARN celular se extrajo con el reactivo RNX (Zist Idea) y se transcribió inversamente a ADNc con el kit de síntesis de ADNc de primera cadena PrimeScript (Irán). Finalmente, se determinaron los niveles de Col1 y factor de transcripción relacionado con runt-2 (Runx2). Cada grupo fue examinado tres veces. Los detalles del diseño del cebador utilizado en este estudio se encuentran en la Tabla 1.

Todos los datos se recopilaron por triplicado y los gráficos se generaron utilizando el software Graphpad prism 8. Se utilizó Anova de dos vías para estudiar la importancia de las diferencias entre los grupos.

La figura 2a muestra los espectros UV-Vis de GO, BSA-rGO y BSA. GO, una forma de pasión de las familias de grafeno, mostró un espectro UV-Vis único. En estos espectros, los picos característicos de GO fueron 225 y 310 nm atribuidos a interacciones π-π y n-π, respectivamente. El proceso de exfoliación y oxidación del grafeno producido se ha confirmado con la aparición de estos picos. Después de reducir GO con BSA, el pico a 232 nm se desplazó a 260 nm y la intensidad del pico a 310 nm disminuyó significativamente. Al administrar las moléculas de BSA en el GO, estos picos cambiaron o desaparecieron debido al proceso de reducción. Descubrimos que el color marrón de GO cambió a negro después de la reducción, y el color negro se mantuvo estable cuando se agregó Sr a la mezcla BSA-rGO (Fig. 2b, las imágenes se registraron 1 semana después de la síntesis). Los patrones XRD de GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO son visibles en la Fig. 2c. El patrón correspondiente a GO muestra un pico característico en 2θ = 12,3° atribuido al espaciado (001). De acuerdo con la ecuación de Scherrer y el espacio d para el óxido de grafeno producido, la altura de apilamiento y el número de capas son 8,9 nm y 8, respectivamente. Debido al enlace amida de BSA, se detectó en BSA-rGO el pico ancho y bastante fuerte ubicado en el rango de 20 a 27°. Mientras tanto, debido a la dispersión homogénea de GO dentro de BSA, no hay un pico de GO característico en los patrones XRD de los compuestos BSA-rGO, lo que implica un desorden de largo alcance o una exfoliación completa de GO en BSA-rGO, por lo que el resultado es consistente. con investigaciones previas25. En el patrón XRD final, se observaron los picos característicos de estroncio metálico y nanoláminas rGO. Los picos a 25,42° y 29,46° correspondieron a los planos cristalinos [111] y [200] de la estructura cúbica compacta del estroncio (JCPDS 89-4045), mientras que los picos débiles y anchos de BSA-rGO pudieron detectarse a 20–27°. La reducción en la intensidad máxima de rGO muestra que los SrNP metálicos adheridos a su superficie impidieron que las nanoláminas BSA-rGO se reapilaran, lo que resultó en nanoláminas Sr-BSA-rGO exfoliadas mejor que las nanoláminas BSA-rGO.

Caracterización de nanoláminas Sr-BSA-rGO. (a) Los espectros UV-Vis de BSA, GO y BSA-rGO dispersos en agua desionizada (concentración: 0,1 mg/ml). ( b ) Imágenes de GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO sintetizados. ( c ) y ( d ) Perfiles XRD y FTIR de nanoláminas GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO respectivamente.

Se ha demostrado que el crecimiento de NPs metálicas en GO o rGO hace que los picos de grafito apilados desaparezcan o disminuyan, porque las partículas metálicas impiden que se vuelvan a apilar. La existencia de SrNP metálicos cristalinos en la superficie de rGO bien exfoliada se validó mediante datos XRD, que indicaron la síntesis de GO y la reducción sérica de GO a rGO. Los espectros FTIR de GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO sintetizados se han presentado en la Fig. 2d. Los picos GO característicos en el espectro FTIR corresponden a 3386 cm−1, 1728 cm−1 y 1615 cm−1 con los enlaces O–H, C=O y C=C, respectivamente26. Además, los picos en 1050 cm−1 y 1224 cm−1 se relacionan con la vibración de estiramiento C–O, y también, el pico característico de 1376 cm−1 pertenece a la vibración de deformación de C–O27. Ha habido varios cambios en el patrón BSA-rGO en comparación con el GO. El pico a 630 cm−1, que era específico de la vibración de mezcla de O=C–NH, estaba relacionado con la unión del BSA depositado en el compuesto GO. El nuevo pico apareció a 2850 cm-1, fue para las vibraciones de estiramiento C-H del grupo funcional metileno de BSA25. En resumen, para las nanoláminas GO y BSA-rGO, la aparición de picos a 630 cm−1 y 2850 cm−1 en los compuestos que contienen BSA, a diferencia de las nanopartículas GO, confirmó la formación del compuesto BSA-rGO. Se pudo evidenciar la disminución de Sr-BSA-rGO a 630 cm−1 y 2850 cm−1 y los SrNP con carga positiva estaban fuertemente decorados en la superficie de las nanoláminas de rGO. Por otro lado, observamos la reducción de los grupos hidroxilo al introducir nitrato de estroncio. Según los informes anteriores, los grupos hidroxilo podrían interactuar con los iones Sr2+ debido a la electronegatividad y después de la decoración con Sr, la intensidad de los grupos hidroxilo en los espectros FTIR se reduciría28.

La espectroscopia Raman es una técnica útil para caracterizar las nanoláminas basadas en carbono, ya que proporcionan información valiosa sobre la estructura cristalina de los materiales basados en grafeno. Una variedad de grupos de oxígeno de la oxidación del grafito establecen una estructura extremadamente irregular de GO. La figura 3a muestra los espectros Raman de las nanoláminas GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO. Todos los patrones exhibieron dos picos principales correspondientes a las bandas D y G. La banda D reveló la presencia de sitios de carbono que estaban incompletos y desordenados, mientras que la banda G se asoció con átomos de carbono que estaban organizados29. Las bandas D y G (ID/IG) fueron los parámetros críticos para determinar la estructura grafítica ordenada y desordenada27. Entendemos las transformadas estructurales por el aumento o disminución de la Relación de Intensidad relativa (ID/IG). El espectro Raman de BSA-rGO exhibió dos picos en 1347 cm-1 y 1599 cm-1 relacionados con las bandas D y G, respectivamente. La banda G de BSA-rGO corresponde a la restauración de los defectos según la red hexagonal de átomos de carbono30. La relación ID/IG relativa fue de 1,108 que confirmó el proceso de reducción de la estructura GO, generando una gran cantidad de defectos constructivos30. Después de la adsorción de estroncio, la banda D se mantuvo en 1347 cm-1 y la banda G se movió a 1594 cm-1. El ligero crecimiento de la intensidad de la banda G resultó en una disminución de la relación (ID/IG: 0,976), lo que indica una fuerte interacción entre el híbrido BSA-rGO y el estroncio. Los SrNP metálicos mejoraron la estructura desordenada de BSA-rGO, lo que confirmó que había una fuerte interacción con el entrecruzamiento exitoso de estroncio en sitios defectuosos de BSA-rGO27. Las muestras se prepararon para la formación de imágenes AFM por fundición en el portaobjetos de vidrio y el disolvente se evaporó a temperatura ambiente durante la noche. La Figura 3b-g muestra las diversas imágenes AFM y las medidas del perfil de altura. De acuerdo con el perfil de altura de las imágenes AFM, el grosor de BSA-rGO ha superado en comparación con el grosor de GO, lo que sugiere que BSA puede haber sido adsorbido en rGO como estabilizador a través de interacciones hidrofóbicas y de apilamiento π-π. Otro hallazgo fue que el espesor promedio típico del nanocompuesto Sr-BSA-rGO fue más significativo que el espesor promedio típico de RGO atribuido a la presencia de SrNP en la superficie. El aumento en el grosor de las nanoláminas de grafeno después del recubrimiento se informó anteriormente. Por ejemplo, Upadhyay et al. informó que el aumento en el grosor de las nanoláminas GO de 1 a 110 nm se detectó cuando el polietileno se injertó en la superficie de GO31. En el otro trabajo, la reducción y decoración de nanoláminas GO con polidopamina mejoró el grosor de las nanoláminas GO32. Anteriormente, también utilizamos un anticuerpo monoclonal llamado Herceptin para sintetizar y marcar láminas de grafeno in situ, y encontramos una mejora del grosor del grafeno al introducir el anticuerpo33.

Estructural y morfología de nanoláminas. ( a ) Espectro Raman de nanoláminas GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO. ( b – d ) Imágenes AFM de nanohojas GO, BSA-rGO, Sr-BSA-rGO respectivamente. ( e – g ) El perfil de espesor de GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO respectivamente.

Según nuestros hallazgos, el valor del potencial zeta para GO es −28.5 mV (Fig. 4). Eso se debe principalmente a los grupos funcionales de oxígeno en la superficie de GO y las densidades de carga negativa residual. Sin embargo, el voltaje de BSA-rGO disminuye a −29,47 mV que se vuelve más negativo en comparación con GO. Muestra que BSA-rGO tenía una dispersión acuosa más estable que GO, debido a los segmentos hidrofílicos de BSA. Las SrNP tenían un valor de potencial zeta de −6 mV debido a su baja solubilidad en agua, mientras que Sr-BSA-rGO representaba un valor de potencial zeta de −22,03 mV. La diferencia entre BSA-rGO y Sr-BSA-rGO indicó la unión del pozo de estroncio metálico en BSA-rGO. A pesar de este enlace, las nanoláminas Sr-BSA-rGO tenían un valor negativo, lo que indica estabilidad en un medio acuático.

Potencial zeta de GO, BSA, Sr, BSA-rGO (ilustrado como RGO) y Sr-BSA-rGO (ilustrado como RGO-Sr).

Para confirmar el ensamblaje de SrNP en la superficie de las nanoláminas BSA-rGO, utilizamos FESEM. Como se muestra en la Fig. 5, los SrNP en forma dispersa y agrupada se depositaron en la superficie de las nanoláminas BSA-rGO. También usamos la opción de electrones retrodispersados de FESEM para una mejor ilustración de los SrNP en la superficie de las nanoláminas (Fig. 5b). Se ha observado que las SrNP son más ligeras que las nanoláminas de grafeno. De acuerdo con la Fig. 5c, el tamaño de las SrNP se observó cerca de 20 nm y las SrNP poseían una forma esférica. El espectro EDS de Sr-BSA-rGO exhibió que la aparición del estroncio con un porcentaje en peso del 10,57% era una clara evidencia de la decoración efectiva de SrNP en la gran superficie de BSA-rGO (Fig. 5d). La dispersión de SrNP en la superficie de BSA-rGO se controló mediante análisis de mapeo de elementos. El nanocompuesto híbrido contenía C, O, N y Sr como los componentes principales, y cada elemento se dispersó uniformemente (Fig. 6), lo cual estuvo de acuerdo con las imágenes FESEM.

Imágenes FESEM de nanoláminas Sr-BSA-rGO. (a) y (c) Imagen de electrones secundarios. ( b ) Imagen de electrones retrodispersados (las flechas amarillas revelan Sr NP). ( d ) Análisis EDS de nanohojas Sr-BSA-rGO.

( a – e ) Imágenes de mapeo elemental de elementos C, N, O y Sr de Sr-BSA-rGO. (f) Imagen fusionada de carbono y estroncio. (g) Imagen fusionada de carbono y estroncio en FESEM.

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es una técnica eficiente para determinar el tamaño de grano, la distribución del tamaño y la forma de las NP ensambladas. Las figuras 7a,b ilustran imágenes TEM de nanoláminas GO y BSA-rGO16. No hubo signos de agregación en las nanoláminas GO después de la reducción con BSA, y la figura representaba las nanoláminas rugosas que ya habían sido exfoliadas, revelando una amplia área de superficie plegada y una estructura agrupada. Estas imágenes respaldaron nuestro XRD y confirmaron que no hay agregación de nanoláminas GO en presencia de BSA. La Figura 7c,d demostró grupos de estroncio bien dispersos y NP monodispersos en la superficie de nanoláminas BSA-rGO). Los puntos negros en la Fig. 7c, d mostraban las NP de estroncio metálico cristalino que se dispersaron de manera idéntica en la superficie de las nanoláminas rGO arrugadas hidrofílicas.

Imágenes TEM de ( a ) GO, ( b ) BSA-rGO y ( c, d ) nanohojas Sr-BSA-rGO. Los puntos negros en las imágenes TEM eran nanopartículas de Sr.

Estudiamos la citotoxicidad de las nanoláminas GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO utilizando el ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 8a, las nanoláminas GO redujeron la viabilidad de las células MC3T3-E1 al 70, 55 y 47 % en comparación con el control después de la incubación durante 24, 72 y 120 h a una concentración constante (100 μg/ml), respectivamente. Los porcentajes de viabilidad celular para incubaciones de 24, 72 y 120 h con BSA-rGO fueron del 80, 70 y 75 %, respectivamente. Las nanoláminas BSA-rGO aumentaron la viabilidad de las células en comparación con GO en la misma concentración. Para estudiar mejor el efecto de las nanoláminas Sr-BSA-rGO en la viabilidad de las células, utilizamos varias concentraciones de nanoláminas Sr-BSA-rGO (1, 10, 50, 100 μg/ml). El porcentaje de viabilidad celular fue superior al 80 % para las células incubadas con diferentes concentraciones de nanoláminas Sr-BSA-rGO. Estas nanoláminas demostraron la mayor viabilidad celular en comparación con GO y BSA-rGO. La toxicidad de GO ha sido ampliamente investigada y GO tenía una toxicidad insignificante en altas concentraciones. Además, las nanoláminas y los sustratos recubiertos de proteínas tenían un gran potencial para mejorar la proliferación y viabilidad celular. Por ejemplo, Ahadian et al. informó una solución acuosa de nanoláminas de grafeno mediante el uso de BSA y grafito que pudieron aumentar la viabilidad celular y la tasa de proliferación22. Además, encontramos la viabilidad celular mejorada para los grupos tratados con nanoláminas Sr-BSA-rGO en diferentes concentraciones. Debido a la interacción no covalente de las SrNP y las nanoláminas de grafeno, pueden liberarse en el medio de cultivo. Los iones Sr tenían la capacidad de impulsar la viabilidad celular, especialmente en la ingeniería de tejido óseo15.

Evaluación biológica de las nanoláminas sintetizadas. ( a ) Medición de la viabilidad celular (ensayo MTT) de células MC3T3-E1 tratadas con diferentes concentraciones de Sr-BSA-rGO (1, 10, 50, 100 μg / ml) y una concentración constante de GO y BSA-rGO (100 μg/ml) a varios tiempos de incubación (24, 72 y 120 h). (b) Medición de la actividad ALP de las células MC3T3-E1 tratadas con una concentración constante de nanoláminas GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO (100 μg/ml) a diferentes tiempos de incubación (24, 72 y 120 h). Todos los experimentos se realizaron por triplicado (n = 3). ( c ) Efecto de Sr-BSA-rGO en la diferenciación osteogénica de células MC3T3-E1. Se usaron nanoláminas Sr-BSA-rGO para tratar las células MC3T3-E1 en 100 g/ml. (d) Después de un período de incubación de 24, 72 y 120 h, se utilizó RT-PCR para detectar los niveles de expresión de RUNX2 y Col 1A1, y su normalización se realizó frente a GAPDH.

Aquí, también estudiamos la actividad ALP de GO, BSA-rGO y Sr-BSA-rGO. La concentración de nanoláminas fue constante (100 µg/ml) y el experimento se siguió durante 24, 72 y 120 h. Las nanoláminas Sr-BSA-rGO impulsaron la actividad ALP de las células MC3T3-E1 en comparación con GO y BSA-rGO, y esta tendencia fue similar durante 72 y 120 h (Fig. 8c). Se utilizó RT-PCR para evaluar la diferenciación osteogénica del Sr-BSA-rGO inducido por células MC3T3-E1. Como se muestra en la Fig. 8b, d, el tratamiento con 100 μg/ml de Sr-BSA-rGO mejoró significativamente la expresión de los genes RUNX2 y Col1A1. Curiosamente, se observó una tendencia similar en la actividad ALP y el ensayo MTT. Después del tratamiento con Sr-BSA-rGO durante 120 h, las células MC3T3-E1 exhibieron el nivel más alto de actividad ALP a la concentración de 100 μg/ml. En conjunto, estos experimentos revelaron que 100 μg/ml de Sr-BSA-rGO provocaron los efectos más pronunciados sobre la diferenciación osteogénica de las células MC3T3-E1.

Brevemente, sugerimos un enfoque simple para la síntesis mediada por BSA in situ de nanoláminas rGO decoradas con Sr de acuerdo con la reducción / decoración basada en proteínas. La espectroscopia UV-Vis, Raman, XRD y FTIR mostró que BSA tenía un papel principal en la reducción y decoración de SrNP en la superficie de las nanoláminas rGO. Las imágenes SEM y TEM verificaron la deposición de SrNP en el área de superficie prominente de BSA-rGO. Después del tratamiento con nanoláminas Sr-rGO, las células MC3T3-E1 mostraron una actividad ALP mejorada en comparación con GO y BSA-rGO, y esta tendencia se observó en 72 y 120 h de tratamiento, respectivamente. En comparación con GO y BSA-rGO, la citotoxicidad de las nanoláminas Sr-BSA-rGO en un experimento MTT mostró la mejor viabilidad celular. Después del tratamiento con Sr-BSA-rGO durante 120 h, las células MC3T3-E1 presentaron el mayor nivel de bioactividad a 100 μg/ml. En general, este estudio demostró que 100 μg/ml de Sr-BSA-rGO establecieron los impactos más notables en la osteogénesis y la diferenciación osteogénica de las células MC3T3-E1. Parece que el uso de nanobiomateriales híbridos sintéticos puede ofrecer una ruta viable para la provisión de biomateriales de sustitución ósea en el contexto de la regeneración de tejidos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Estos autores contribuyeron por igual: Hossein Akbari y Esfandyar Askari.

Escuela de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, Universidad de Teherán, Teherán, Irán

Hossein Akbari y Zeinab Salehi

Grupo de Investigación de Biomateriales e Ingeniería de Tejidos, Departamento de Tecnologías Interdisciplinarias, Centro de Investigación de Cáncer de Mama, Instituto de Cáncer Motamed, ACECR, Teherán, Irán

Esfandyar Askari

Departamento de Nanotecnología, Escuela de Tecnologías Avanzadas, Universidad de Ciencia y Tecnología de Irán (IUST), PO Box 16846-13114, Teherán, Irán

Esfandyar Askari y Seyed Morteza Naghib

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HA y EA realizaron procedimientos experimentales. SMN y ZS supervisaron, convencieron la idea y revisaron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Seyed Morteza Naghib.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Akbari, H., Askari, E., Naghib, SM et al. Estroncio decorado con grafeno funcionalizado con albúmina de suero bovino como una potente nanopartícula compleja para la ingeniería de tejido óseo. Informe científico 12, 12336 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16568-7

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Recibido: 02 Abril 2022

Aceptado: 12 julio 2022

Publicado: 19 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16568-7

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