Un nuevo polipéptido

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 6624 (2022) Citar este artículo

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Los nanorracimos de oro fluorescente funcionalizados con biomoléculas (AuNC) han atraído mucha atención debido a su buena biocompatibilidad, propiedades fisicoquímicas estables y considerables ventajas económicas. La concentración inadecuada de Cu2+ puede causar una variedad de enfermedades. En este estudio, los AuNC se sintetizaron en solución acuosa alcalina utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como plantilla. Y luego, el péptido CCYWDAHRDY se acopló a AuNC. Además, se evaluó la fluorescencia de la respuesta de CCYWDAHRDY-AuNC sintetizada a Cu2+. Como los resultados mostraron que los CCYWDAHRDY-AuNC pueden detectar con sensibilidad Cu2+. Después de agregar Cu2+ al sistema de sonda, se extinguió la fluorescencia de los CCYWDAHRDY-AuNC. Las condiciones de detección fueron a pH 6 y 30 °C durante 10 min, la relación lineal entre la concentración de Cu2+ y la intensidad de fluorescencia fue buena en el rango de 0,1 ~ 4,2 μmol/L. La ecuación de regresión fue y = − 105,9x + 693,68, el coeficiente de correlación lineal es 0,997 y el límite mínimo de detección fue 52 nmol/L.

La acumulación de iones de metales pesados en el sistema ambiental aumenta el riesgo de daño al medio ambiente y la salud humana1,2,3,4,5. Los iones de metales pesados pueden interferir fácilmente con las enzimas y los ácidos nucleicos y cambiar las actividades biológicas de los organismos6. Cu2+ juega un papel importante en la biología como metal de transición, y la ingesta adecuada de Cu2+ es necesaria para mantener la salud del organismo7,8. Sin embargo, una concentración inapropiada de Cu2+ puede causar una variedad de enfermedades. Por ejemplo, la anemia y la disminución de la visión son síntomas causados por la falta de Cu2+, y un contenido excesivo de Cu2+ puede acelerar el deterioro de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson9,10,11,12,13. Los Cu2+ están ampliamente distribuidos en el suelo y el agua, por lo que ingresan fácilmente al cuerpo humano a través de la cadena alimentaria. El monitoreo en tiempo real de Cu2+ es un requisito previo para la seguridad alimentaria y la prevención de enfermedades14,15. La espectroscopia de fluorescencia, la colorimetría, el análisis electroquímico y la cromatografía de gases se han aplicado a la detección de Cu2+16,17,18,19,20. La tecnología de análisis de fluorescencia ha atraído una gran atención debido a su alta sensibilidad, fácil operación y rápida velocidad de detección. Con el desarrollo de nanomateriales y sondas fluorescentes, los nanoclusters de oro (AuNC) como sensores fluorescentes para la detección de contaminantes en el medio ambiente y los alimentos han atraído la atención de muchos investigadores21,22.

Los AuNC están compuestos por decenas o incluso cientos de átomos de oro, con un tamaño de partícula medio inferior a 2 nm23,24. En comparación con los tintes o proteínas fluorescentes tradicionales, los AuNC tienen excelentes propiedades, como poco efecto sobre la actividad de los organismos, alta estabilidad, baja toxicidad y alta biocompatibilidad debido a su inercia química y tamaño ultrafino25. Además, los AuNC tienen un cambio de Stokes más grande y una emisión de fluorescencia más intensa26. Con la adición de cationes metálicos multivalentes, el enlace Au-S en la superficie de AuNC se rompe debido a la interacción de los grupos carboxilo y los iones metálicos, lo que da como resultado la extinción de la luminiscencia27,28.

Las propiedades de fluorescencia de AuNC se pueden ajustar mediante el uso de ligandos apropiados y andamios biocompatibles29,30. Estudios previos han demostrado que los AuNC pueden prepararse usando proteínas, aminoácidos, péptidos, tioles, ácidos nucleicos y otras biomoléculas como ligandos, que tienen un alto grado de biocompatibilidad y pueden usarse para la detección sin interferencias de materiales biológicos31,32,33, 34. En particular, los péptidos se utilizan a menudo para sintetizar nanoclusters metálicos biocompatibles y funcionales debido a su estructura tridimensional especial, secuencia ajustable, síntesis conveniente y precio económico33. Por ejemplo, Yuan y sus colaboradores compararon las NC Au25 protegidas por ácido nucleico peptídico de cadena larga GSH con grupos -COOH y -NH2 ricos en electrones que produjeron una luminiscencia más fuerte35. La cisteína (C) tiene una buena capacidad de coordinación36, y la tirosina (Y) tiene una gran capacidad para reducir los iones metálicos37, C e Y generalmente se introducen en la secuencia peptídica para preparar AuNC. Ciertos péptidos se pueden acoplar con AuNC para detectar de manera rápida y efectiva iones altamente tóxicos. Por ejemplo, el sensor de bioluminiscencia CCYR6H4-AuNCs reduce el límite de detección y mejora la selectividad a Hg2+ en agua38.

Las sondas fluorescentes se pueden aplicar al ensayo de Cu2+ debido al comportamiento de extinción de la fluorescencia de Cu2+. En este estudio, se sintetizaron las novedosas sondas fluorescentes de CCYWDAHRDY-AuNC para detectar Cu2+ intracelular en el agua. Primero, se usó BSA como agente reductor y estabilizador para preparar AuNC, y luego la solución CCYWDAHRDY y AuNC se agitaron e incubaron a 25 ° C durante 24 h para obtener CCYWDAHRDY-AuNC. Además, se evaluó la especificidad de las respuestas de CCYWDAHRDY-AuNCs a Cu2+.

Todos los iones metálicos (es decir, Cu2+, Pb2+, Zn2+, Ni2+ y potasio) se adquirieron de Sigma (St Louis, MO, EE. UU.). El ácido cloroáurico (AuCl3·HCl·4H2O), el fosfato ácido de sodio (Na2HPO4) y el fosfato dihidrógeno de sodio (NaH2PO4) se obtuvieron de Sinopharm Chemical Reagent Company (Shanghai, China). La albúmina de suero bovino (BSA) se compró a Changchun Dingguo Reagent Co., Ltd. (Jilin, China). El péptido CCYWDAHRDY se adquirió de GL Biochem (Shanghai) Ltd (Shanghai, China). Todos los productos químicos eran de grado reactivo analítico y se usaron directamente sin purificación adicional. Se utilizó agua destilada durante todo el experimento.

Todo el material de vidrio se limpió en una solución de agua regia recién preparada (relación de volumen de HCl:HNO3 = 3:1) y se enjuagó minuciosamente con agua destilada antes de su uso. En primer lugar, se mezclaron 5 ml de una solución acuosa de HAuCl4 de 10 mmol/l y 5 ml de una solución de BSA de 50 mg/ml con agitación a 37 ℃ durante 5 min. A continuación, se añadió 1 ml de NaOH 1 mol/L a las mezclas anteriores. Y la mezcla se agitó a 37 ℃ durante 24 h para obtener el producto crudo AuNCs. Además, el producto crudo AuNCs se dializó en agua destilada para eliminar el exceso de partículas grandes para obtener AuNCs.

El péptido CCYWDAHRDY diseñado en nuestro estudio fue sintetizado por el procedimiento de fase sólida utilizando los métodos de síntesis de aminoácidos protegidos por FMOC39. La síntesis de CCYWDAHRDY-AuNCs se realizó por el método descrito por nuestro estudio previo40. Primero, el polvo de CCYWDAHRDY se disolvió en agua ultrapura para obtener una solución acuosa de 1 mg/mL de CCYWDAHRDY. En segundo lugar, se agregaron 0,5 ml de solución acuosa de CCYWDAHRDY a 2 ml de solución de AuNC. La mezcla anterior se agitó suavemente a 25 ℃ durante 24 h para obtener una solución de CCYWDAHRDY-AuNCs, que se almacenó a 4 ℃ en la oscuridad.

La intensidad de fluorescencia de AuNC y CCYWDAHRDY-AuNC se midió utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia RF5301 (Shimadzu Enterprise Management (China) Co., Ltd.). La forma y el tamaño de AuNC y CCYWDAHRDY-AuNC se analizaron utilizando el microscopio electrónico de transmisión FEI Titan ETEM G2 (Shanghai Zhengfei Electronic Technology Co. Ltd.). Y el espectro de absorción ultravioleta se midió utilizando el espectrofotómetro UV-Visible UV1800 (Shanghai Precision Instrument Co. Ltd.).

Se mezcló una solución de 0,1 mL de CCYWDAHRDY-AuNCs y una solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 0,84 mL con diferentes valores de pH, es decir, 4, 5, 6, 7 y 8, luego se agregaron 0,06 mL de una solución estándar de Cu2+ de 60 μmol/L . Posteriormente se midió la intensidad de fluorescencia de la mezcla. En el grupo de control, la solución estándar de Cu2+ se reemplazó por una solución de PBS y, posteriormente, se midió la intensidad de fluorescencia de la mezcla.

Se mezclaron 0,1 ml de solución de CCYWDAHRDY-AuNCs y 0,84 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego se agregaron 0,06 ml de solución estándar Cu2+ de 60 μmol/L. Luego, la intensidad de fluorescencia de la mezcla se midió posteriormente a diferentes temperaturas (es decir, 10, 20, 30, 40 y 50 ℃). En el grupo de control, la solución estándar de Cu2+ se reemplazó por una solución de PBS y, posteriormente, se midió la intensidad de fluorescencia de la mezcla.

Se mezclaron 0,1 mL de solución de CCYWDAHRDY-AuNCs y 0,84 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), luego se añadieron 0,06 mL de solución estándar de Cu2+ 60 μmol/L, luego se midió la intensidad de fluorescencia de la mezcla con diferentes tiempos de reacción (es decir, 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 min) se midió posteriormente. En el grupo de control, la solución estándar de Cu2+ se reemplazó por una solución de PBS y, posteriormente, se midió la intensidad de fluorescencia de la mezcla.

Se mezclaron CCYWDAHRDY-AuNC (100 μL) con 0,06 mL de diferentes concentraciones de Cu2+ (es decir, 0,6, 1,2, 1,8, 2,4, 3,0, 3,6 y 4,2 μmol/L) en tampón PBS (pH = 6), el volumen final de el sistema de reacción es de 1 ml. La mezcla se incubó a 30 ℃ durante 10 min. Luego, se realizó un escaneo espectral y se registró en un espectrofotómetro de fluorescencia. La curva de detección de la concentración de Cu2+ se estableció utilizando la eficiencia de fluorescencia (F0/F) como ordenada. F0 y F respectivamente indicaron la máxima intensidad de fluorescencia del sistema de solución en ausencia y presencia de Cu2+. También se registró la intensidad de fluorescencia de AuNC con Cu2+.

Se midieron las intensidades de fluorescencia de la solución de prueba que contenía Cu2+ con diferentes concentraciones de interferencias. Se utilizaron los siguientes iones metálicos: Co2+, Fe3+, Ni2+, Zn2+, Ca2+, K+, Na+, Pb2+.

Los datos se expresaron como medias ± DE (n = 3) y las diferencias se realizaron mediante la prueba ANOVA unidireccional seguida de la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) usando SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.).

Se usó BSA como agente reductor para la reacción de síntesis y agente protector para el grupo. Como se muestra en la Fig. 1 (a), la curva no mostró el pico de absorción característico alrededor de 520 nm de AuNC, por lo tanto, no se produjeron nanocristales durante la síntesis de AuNC, lo que indicó que AuNC tenía un tamaño de partícula pequeño y bien disperso. Como se muestra en la Fig. 1 (b), los AuNC sintetizados eran de color marrón claro/amarillo bajo luz visible y emitían una intensa fluorescencia naranja bajo la iluminación de una lámpara UV de 350 nm. el tamaño de partícula promedio de los AuNC fue de aproximadamente 1,8 nm con una buena dispersión y sin aglomeración de partículas [que se muestra en la Fig. 1 (c)], lo cual fue consistente con informes anteriores41,42.

Caracterización de los AuNC: (a) espectro de absorción UV-visible de los AuNC, (b) Las fotografías de los AuNC (la fotografía de la izquierda es a la luz del día, la fotografía de la derecha muestra una lámpara UV de 350 nm), (c ) La fotografía TEM de los AuNC, ( d ) Espectros de emisión de fluorescencia de AuNC a una longitud de onda de excitación de 260 nm.

Como se muestra en la Fig. 1 (d), y la longitud de onda de emisión máxima de AuNC fue de 650 nm. Los AuNC modificados con BSA tenían nanoestructuras de núcleo-capa Au0-Au1 y la fluorescencia producida era la transferencia de carga entre los ligandos fluorescentes y el Au+. El residuo de tirosina en BSA tenía la capacidad de reducir Au+ a Au en condiciones alcalinas. Al mismo tiempo, el residuo de cisteína en BSA podría capturar los AuNC en el sistema a través del enlace Au-S, y BSA aumentó la estabilidad del sistema de reacción.

La Figura 2 (a) mostró que la dispersabilidad del sistema no cambió cuando el CCYWDAHRDY se combinó con los AuNC. No hubo un cambio evidente en el tamaño de las partículas y no se produjo agregación, lo que sugiere que el sistema tendrá una fuerte emisión de fluorescencia y propiedades estables. Se utilizaron espectros de absorción UV-vis para investigar la caracterización óptica y la estructura de AuNC y CCYWDAHRDY-AuNC. Como se muestra en la Fig. 2 (b), los espectros de los AuNC no cambiaron después del acoplamiento con el CCYWDAHRDY. El CCYWDAHRDY utilizado en nuestros experimentos modificó con éxito los AuNC sin afectar las propiedades de los AuNC38. Se observó en la Fig. 3 (a) que los AuNC acoplados con CCYWDAHRDY eran ligeramente más oscuros que los AuNC bajo luz natural, mientras que la emisión de fluorescencia naranja-roja de los CCYWDAHRDY -AuNC bajo luz ultravioleta era en su mayoría similar a la de los AuNC. .

Caracterización de los CCYWDAHRDY-AuNC: (a) fotografía TEM de los CCYWDAHRDY-AuNC, (b) espectro de absorción UV-visible de los AuNC y los CCYWDAHRDY-AuNC.

La intensidad de fluorescencia de AuNC y CCYWDAHRDY-AuNC: (a) Fotografías de AuNC (1) y CCYWDAHRDY-AuNC (2) a la luz del día (izquierda) y bajo una lámpara UV de 350 nm (derecha), (b) Espectros de emisión de fluorescencia de los AuNC y los CCYWDAHRDY-AuNC a una longitud de onda de excitación de 260 nm.

La fluorescencia de los CCYWDAHRDY-AuNC se comparó con la de los AuNC. Como se muestra en la Fig. 3 (b), la fluorescencia de los AuNC aumentó significativamente después del acoplamiento de CCYWDAHRDY. Que tal vez CCYWDAHRDY contenía una cadena tripeptídica funcional CCY, donde el grupo fenólico en la tirosina podría reducir los iones de oro trivalentes a átomos de oro, y la cisteína podría capturar los AuNC para que el CCYWDAHRDY pudiera unirse a los AuNC. Además, el átomo de oxígeno rico en electrones o el átomo de nitrógeno en el CCYWDAHRDY y el grupo funcional (grupo carboxilo y grupo amino) en el ligando podrían mejorar efectivamente la transferencia de electrones, aumentando así la intensidad de fluorescencia de los AuNC modificados por el CCYWDAHRDY. El triptófano (W) en CCYWDAHRDY tenía una fuerte capacidad reductora, lo que podría promover la formación de AuNC y aumentar la intensidad de la fluorescencia. Al mismo tiempo, el CCYWDAHRDY actuó como un estabilizador adecuado y protegió aún más la fluorescencia de las AuNC evitando así la aglomeración de AuNC en partículas más grandes inducida por factores ambientales externos y mejoró la estabilidad de la fluorescencia de las AuNC.

Para seleccionar las mejores condiciones experimentales, los factores principales incluyen el pH, la temperatura y el tiempo de reacción. Usamos una longitud de onda de excitación de 650 nm y una solución estándar de Cu2+ de 60 μmol/L para detectar la mejor condición de reacción. Se estudiaron los efectos de los diferentes valores de pH en la respuesta de fluorescencia de los CCYWDAHRDY-AuNC y se optimizó el pH del sistema experimental, como se muestra en la Fig. 4 (a). Cuando el pH del sistema era 6, la relación de intensidad de fluorescencia F0/F era la más alta. Cuando el pH aumentó, F0/F se estabilizó y disminuyó ligeramente. Por lo tanto, se eligió el tampón PBS a pH 6,0 como la condición de detección óptima.

Influencia de diferentes factores ambientales en el efecto de extinción de Cu2+ CCYWDAHRDY-AuNCs Fluorescencia: (a) Intensidad de emisión de fluorescencia de CCYWDAHRDY-AuNCs a Cu2+ a diferentes valores de pH, (b) Intensidad de emisión de fluorescencia de CCYWDAHRDY-AuNCs a Cu2+ a diferentes temperaturas, (c) Evolución de la intensidad de la emisión de fluorescencia de CCYWDAHRDY-AuNCs a Cu2+ a lo largo del tiempo.

La temperatura desempeñó un papel dominante en el sistema de extinción de la fluorescencia. Se investigó el efecto de la temperatura en la detección. Como se muestra en la Fig. 4(b), cuando la temperatura aumentó de 10 a 30 °C, la relación de intensidad de fluorescencia F0/F aumentó gradualmente y la relación de intensidad de fluorescencia F0/F alcanzó un máximo a 30 °C. Cuando la temperatura continuó aumentando, la relación de extinción disminuyó gradualmente. Por lo tanto, 30 °C fue la temperatura óptima de detección.

La extinción de la fluorescencia de CCYWDAHRDY-AuNC por Cu2+ se estudió en función del tiempo de reacción (Fig. 4c). La intensidad de fluorescencia de la reacción disminuyó rápidamente en 0 ~ 5 min. La intensidad de la fluorescencia disminuyó con el tiempo. Después de 10 min, la fluorescencia permaneció relativamente estable y no disminuyó significativamente. Por lo tanto, se consideró que 10 min era el tiempo de reacción óptimo.

El acoplamiento exitoso de CCYWDAHRDY y AuNC podría lograr un monitoreo altamente sensible de Cu2+. La secuencia tripeptídica DHA podría superponerse orbitalmente con Cu2+ a través de átomos de nitrógeno para formar una estructura plana estable, que podría lograr el propósito de identificar Cu2+. Los CCYWDAHRDY-AuNC en las condiciones de reacción óptimas se utilizaron para detectar cuantitativamente Cu2+. Como se muestra en la Fig. 5, para un rango de concentraciones de Cu2+ dentro de 0.1 ~ 4.2 μmol/L, la intensidad de fluorescencia de CCYWDAHRDY-AuNCs y F0/F disminuye gradualmente cuando aumenta la concentración de Cu2+ agregada al sistema de fluorescencia CCYWDAHRDY-AuNCs. Existe una correlación lineal entre F0/F y las concentraciones de Cu2+. La ecuación de regresión lineal fue y = − 105,9x + 693,68 con un coeficiente de correlación de 0,997. El límite mínimo de detección para S/N = 3 fue de 52 nmol/L. Como se muestra en la Tabla 1, en comparación con estudios anteriores, el límite de detección del ensayo para Cu2+ detectado por CCYWDAHRDY-AuNC fue menor. También es inferior a la concentración máxima permitida de Cu 2+ en agua potable establecida por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) (20 y 30 μmol/L, respectivamente). En general, los CCYWDAHRDY-AuNC tendrán amplias perspectivas de aplicación para la determinación de Cu2+.

Respuesta de fluorescencia de los CCYWDAHRDY-AuNCs a las diferentes concentraciones de Cu2+.

Como se muestra en la Fig. 6, la pendiente de la curva de respuesta de los AuNC de CCYWDAHRDY a la concentración de Cu2+ fue mayor que la de los AuNC, lo que indicó que los AuNC de CCYWDAHRDY tenían una mayor sensibilidad. La secuencia tripeptídica DAH podría formar una estructura plana estable con el Cu2+. Por lo tanto, en todo el sistema de detección de fluorescencia, los CCYWDAHRDY-AuNC pueden reconocer Cu2+ con mayor sensibilidad.

Respuesta de fluorescencia de los AuNCs y CCYWDAHRDY-AuNCsand the a las diferentes concentraciones de Cu2+.

Para evaluar la selectividad del sistema de determinación de CCYWDAHRDY-AuNCs a Cu2+, se detectó el impacto de otros iones metálicos, es decir, Co2+, Fe3+, Ni2+, Zn2+, Ca2+, K+, Na+ y Pb2+ en la respuesta de fluorescencia. Como se muestra en la Fig. 7, con la adición de otros iones metálicos, la fluorescencia de los CCYWDAHRDY-AuNC no se extinguió significativamente, incluso la concentración de otros iones que interfirieron fue 10 veces mayor que la de Cu2+. Por lo tanto, el método tiene buena sensibilidad y selectividad. Los CCYWDAHRDY-AuNC preparados tienen buena fluorescencia y estabilidad, por lo que se puede garantizar la repetibilidad de los resultados de la prueba.

Respuesta de fluorescencia de los CCYWDAHRDY-AuNC tras la adición de varios iones. La concentración de Cu2+ fue de 60 μmol/L y la concentración de otros iones metálicos fue de 600 μmol/L.

En resumen, se diseñó la secuencia CCYWDAHRDY y se sintetizó con éxito CCYWDAHRDY-AuNCs. Las condiciones óptimas de síntesis de pH fueron 6,0, el tiempo de reacción fue de 10 min y la temperatura de calcinación fue de 30 °C. Los CCYWDAHRDY-AuNC mostraron una alta selectividad a Cu2+, y el límite mínimo de detección fue de 52 nmol/L, la intensidad de fluorescencia de Cu2+ y CCYWDAHRDY-AuNC fue lineal en el rango de 0,1 ~ 4,2 μmol/L. En comparación con AuNCs, la detección de Cu2+ por CCYWDAHRDY-AuNCs fue más sensible con una alta especificidad. Estos resultados indicaron que los CCYWDAHRDY-AuNC sintetizados podrían usarse para detectar el Cu2+.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2018YFC1602205-2) y el Programa del Plan de Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la provincia de Jilin (20190301027NY).

Facultad de Ciencias e Ingeniería de Alimentos, Universidad de Jilin, No. 5333 Xi'an Road, Changchun, 130062, China

Hong Zhuang, Xinyu Jiang, Sijia Wu, Shujin Wang, Yong Pang, Yanjun Huang y Haiyang Yan

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Correspondencia a Haiyang Yan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Zhuang, H., Jiang, X., Wu, S. et al. Un novedoso nanocluster de oro fluorescente modificado con polipéptidos para la detección de iones de cobre. Informe científico 12, 6624 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10500-9

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Recibido: 06 Septiembre 2021

Aceptado: 04 abril 2022

Publicado: 22 abril 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10500-9

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