El aprendizaje multisensorial une las neuronas en una cruz

Nature, volumen 617, páginas 777–784 (2023)Citar este artículo

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Asociar múltiples señales sensoriales con objetos y experiencias es un proceso cerebral fundamental que mejora el reconocimiento de objetos y el rendimiento de la memoria. Sin embargo, se desconocen los mecanismos neuronales que unen las características sensoriales durante el aprendizaje y aumentan la expresión de la memoria. Aquí demostramos memoria apetitiva y aversiva multisensorial en Drosophila. La combinación de colores y olores mejoró el rendimiento de la memoria, incluso cuando cada modalidad sensorial se probó por separado. El control temporal de la función neuronal reveló que se requieren células de Kenyon (KC) de cuerpo de hongo visualmente selectivas para mejorar la memoria visual y olfativa después del entrenamiento multisensorial. Las imágenes de voltaje en moscas fijas en la cabeza mostraron que el aprendizaje multisensorial une la actividad entre flujos de KC específicos de modalidad para que la entrada sensorial unimodal genere una respuesta neuronal multimodal. La unión se produce entre las regiones de los axones KC olfativos y visuales, que reciben un refuerzo dopaminérgico relevante para la valencia y se propaga corriente abajo. La dopamina libera localmente la inhibición GABAérgica para permitir que microcircuitos específicos dentro de las neuronas serotoninérgicas que abarcan KC funcionen como un puente excitatorio entre las corrientes de KC previamente 'selectivas de modalidad'. El enlace intermodal expande los KC que representan el engrama de memoria para cada modalidad en aquellos que representan a la otra. Esta ampliación del engrama mejora el rendimiento de la memoria después del aprendizaje multisensorial y permite que una sola característica sensorial recupere la memoria de la experiencia multimodal.

La vida es una rica experiencia multisensorial para la mayoría de los animales. Como resultado, los sistemas nerviosos han evolucionado para usar representaciones multisensoriales de objetos, escenas y eventos para guiar el comportamiento de manera más efectiva1. Es ampliamente apreciado que el aprendizaje multisensorial mejora el rendimiento de la memoria, desde niños en el aula hasta roedores e insectos en experimentos de laboratorio controlados2,3,4,5. Además, una característica aparentemente universal e inexplicada del aprendizaje multisensorial es que mejora el rendimiento de la memoria posterior incluso para los componentes unisensoriales separados3,5. Los estudios en humanos y otros mamíferos han sugerido que el aprendizaje multisensorial se beneficia de las interacciones entre las cortezas específicas de la modalidad que fueron coactivas durante el entrenamiento, y que los sentidos individuales pueden reactivar ambas áreas en las pruebas3,6,7,8,9. Además, las células en diferentes regiones del cerebro responden a múltiples señales sensoriales y las proporciones o números cambian después del aprendizaje multisensorial1,10,11,12. Sin embargo, actualmente carecemos de una comprensión mecanicista detallada de cómo el aprendizaje multisensorial convierte a las neuronas de ser selectivas de modalidad a multimodal, y cómo dicho proceso podría respaldar el rendimiento mejorado de la memoria multisensorial y unisensorial.

En Drosophila, poblaciones únicas de KC de cuerpo de hongo (MB) reciben información dendrítica predominante y anatómicamente segregada de neuronas olfativas o de proyección visual (así como interneuronas visuales locales) y sus axones se proyectan como corrientes paralelas en los lóbulos MB. Allí, los compartimentos sucesivos del árbol axonal de cada KC son atravesados ​​por las presinapsis de las neuronas dopaminérgicas (DAN) que transmiten los efectos de refuerzo de los estímulos apetitivos o aversivos13,14. El refuerzo de la dopamina deprime las sinapsis entre los KC activos y las dendritas restringidas al compartimento de las neuronas de salida de MB aguas abajo para codificar memorias específicas de valencia15,16,17.

Para estudiar el aprendizaje multisensorial en Drosophila, adaptamos el T-maze18 olfativo para que los colores y los olores se puedan presentar juntos (Fig. 1a). Las moscas privadas de alimento fueron entrenadas presentándoles un color y/u olor (estímulo condicionado menos (CS−)), seguido de otro color y/u olor (estímulo condicionado más (CS+)) emparejado con una recompensa de azúcar (Fig. 1a, b). Cuando se entrenaron y probaron solo con colores (aprendizaje visual), las moscas no mostraron una preferencia aprendida significativa por el color previamente emparejado con azúcar (Fig. 1b-d y Datos extendidos Fig. 1a). Sin embargo, la combinación de colores con olores (protocolo congruente) produjo una memoria robusta y duradera, que mejoró significativamente con respecto a la formada por el entrenamiento solo con olores (aprendizaje olfativo) (Fig. 1b–d y Datos extendidos Fig. 1a,b). Si las combinaciones de colores y olores se intercambiaron entre el entrenamiento y la prueba (protocolo incongruente) (Fig. 1b–d y Datos extendidos Fig. 1a,b), no se observó mejora de la memoria. Además, la mejora de la memoria no era evidente si se presentaba el mismo color con olores CS− y CS+ durante el entrenamiento y la prueba (Datos ampliados, Fig. 1c). Por lo tanto, el efecto de mejora de la memoria del aprendizaje multisensorial requiere una relación aprendida entre combinaciones específicas de colores y olores. Para la memoria medida 6 h después del entrenamiento, el protocolo incongruente reveló un rendimiento significativamente menor en comparación con el siguiente al aprendizaje olfativo (Fig. 1d), lo que sugiere que las moscas entran en conflicto cuando la contingencia de color y olor se cambia entre el entrenamiento y la prueba.

a, Aparato para entrenamiento y pruebas multisensoriales (izquierda) y la línea de tiempo experimental (derecha). b, Protocolos. Los cuadrados verde y azul representan colores, y los cuadrados gris claro y oscuro representan olores a 3-octanol (OCT) y 4-metilciclohexanol (MCH). Para el aprendizaje visual (V), los colores se usaron como CS+ y CS−. Para el aprendizaje olfativo (O), se utilizaron olores como CS+ y CS−. Para el protocolo congruente (C), los colores + olores se combinaron como CS+ y CS− y se usaron las mismas combinaciones de color + olor para el entrenamiento y la prueba. Para el protocolo incongruente (I), los colores y los olores se combinaron como CS+ y CS−, pero las combinaciones se cambiaron entre entrenamiento y prueba. Para la recuperación olfativa (OR), se usaron combinaciones de color + olor para el entrenamiento, pero solo se usaron olores para la prueba. Para la recuperación visual (VR), se usaron combinaciones de color + olor para el entrenamiento, pero solo se usaron colores para la prueba. c, d, cronogramas de entrenamiento y prueba (arriba), y memoria inmediata (c) y 6 h (d) para protocolos V, O, C e I (abajo). e,f, Líneas de tiempo (arriba) y entrenamiento multisensorial con colores + olores probados inmediatamente (e) y 6 h (f) después del entrenamiento para cada modalidad individual (abajo). Los asteriscos indican una diferencia significativa (P < 0,05). Los datos se presentan como media ± sem Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. Los grupos se compararon mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de Tukey (c, d) y la prueba t de dos lados no apareados (e, f); los valores P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. n = 8 para V y n = 10 para O, C e I (c); n = 10 (d); n = 10 (e); y n = 14 para O y OR y n = 10 para V y VR (f).

Para investigar más a fondo la mejora de la memoria multimodal, restringimos la presentación de señales multisensoriales al entrenamiento o la prueba. El entrenamiento multisensorial mejoró la recuperación de la memoria incluso cuando cada modalidad se presentó sola durante la prueba (recuperación olfativa y recuperación visual) (Fig. 1e, f). Por el contrario, presentar estímulos multisensoriales solo durante la prueba no facilitó el rendimiento (recuperación multisensorial) (Datos ampliados, Fig. 1d). Además, la mayor mejora en el rendimiento se observó cuando se utilizaron estímulos multisensoriales durante el entrenamiento y las pruebas (Datos ampliados, Fig. 1e). Por lo tanto, el entrenamiento multisensorial mejora el rendimiento de la memoria para los componentes individuales de memoria de color y olor, y la congruencia de la información de color y olor entre el entrenamiento y la prueba mejora aún más el rendimiento. Aunque nuestros experimentos y otros19 implican que las moscas distinguen los colores verde y azul, no descartamos una contribución de matiz y luminancia.

Las dendritas de las poblaciones numéricamente más grandes de KC olfativos dentro del lóbulo αβ, el lóbulo α′β′ y el lóbulo γ (es decir, γ-principal (γm KC)) ocupan los cálices principales del MB, mientras que las poblaciones relativamente pequeñas de KC αβ-posterior (αβp) y γ-dorsal (γd) reciben información predominantemente visual a través de las dendritas en los cálices accesorios14. Los KC γd estaban previamente implicados en el aprendizaje del color19,20. Probamos los roles de los KC visuales γd y αβp en el aprendizaje y la memoria multisensoriales, utilizando la expresión específica de células de un transgén UAS-Shibirets1 (Shits1), que codifica una dinamina21 sensible a la temperatura dominante. A temperaturas superiores a 30 °C, Shits1 bloquea el reciclaje de la membrana y, por lo tanto, perjudica la transmisión sináptica, mientras que la función se puede restaurar volviendo las moscas a menos de 29 °C. El bloqueo de la salida de los KC γd y αβp durante las pruebas a las 6 h eliminó la mejora visual del rendimiento en el protocolo congruente y eliminó la interferencia de la incongruencia; en ambos casos, el rendimiento de la memoria fue similar al de las moscas probadas solo con olores (Fig. 2a–d y Extended Data Fig. 2a–f). Estos resultados sugieren que la actividad en los KC γd y αβp representa el componente visual de la memoria multisensorial (ver también Datos extendidos Fig. 2g, h). El bloqueo de la salida de γd KC (pero no de αβp KC) durante la prueba también afectó el rendimiento para la recuperación de memoria solo de olores en moscas entrenadas multisensoriales (Fig. 2e, f), a pesar de no tener efecto en la recuperación de memoria en moscas entrenadas solo con olores22 (Figura de datos extendida 2a, d). Este resultado inesperado nos llevó a plantear la hipótesis de que el aprendizaje multisensorial podría ampliar la representación de los olores para incluir KC γd 'visuales'.

a, esquema de γd KC (arriba a la izquierda) y la línea de tiempo con cambios de temperatura (línea discontinua) (abajo a la izquierda). También se muestra el bloqueo de la salida de los KC γd durante las pruebas con MB607B-GAL4;UAS-Shits1 en el protocolo congruente (derecha). b, Bloqueo de la salida de γd KC durante la prueba en el protocolo incongruente. c, esquema de αβp KC (arriba a la izquierda) y la línea de tiempo con cambios de temperatura (abajo a la izquierda). También se muestra el bloqueo de la salida de los KC αβp durante las pruebas con c708a-GAL4;UAS-Shits1 en el protocolo congruente (derecha). d, Bloqueo de la salida de αβp KC durante el protocolo incongruente. e, f, línea de tiempo con cambio de temperatura (arriba) y salida de bloqueo de los KC γd (e) y αβp (f) durante la prueba de recuperación olfativa de la memoria multisensorial (abajo). Los asteriscos indican una diferencia significativa (P < 0,05). Los datos se presentan como media ± sem Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. Todos los grupos se compararon mediante ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey; los valores P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. n = 12 (a,b,d,f) y n = 10 (c,e). Ver datos extendidos Fig. 2 para controles.

Para probar directamente las respuestas evocadas por el olor aprendidas en los KC γd después del entrenamiento multisensorial, expresamos el sensor de voltaje UAS-ASAP2f23 en los KC γd y realizamos imágenes funcionales de dos fotones (Fig. 3a-d y Datos extendidos Fig. 3a, b, f ,gramo). Las moscas recibieron entrenamiento multisensorial (color + olor), unisensorial (olor) o no apareado (azúcar presentada 2 minutos después del color + olor). Seis horas después del entrenamiento, se tomaron imágenes de las moscas para las respuestas de olor CS+ y CS−. Las grabaciones de los axones γd KC se realizaron en el compartimento terminal γ5 del lóbulo horizontal MB, ya que los DAN que recompensan el azúcar impulsan la depresión presináptica relevante para el aprendizaje de las sinapsis de las neuronas de salida KC-MB en los compartimentos γ4 y γ524,25. A modo de comparación, tomamos imágenes de las respuestas de γd KC en el compartimento proximal γ1, que alberga el campo presináptico de DAN que proporciona señales de enseñanza aversivas26,27,28. Se demostró previamente que la presentación del olor provoca una inhibición lenta en los KC γd19 y αβp22 de moscas ingenuas. Descubrimos que la presentación del olor a CS- evocó la hiperpolarización de los KC γd en los compartimentos γ1 y γ5, independientemente del protocolo de entrenamiento (Fig. 3a-d y Datos extendidos Fig. 3a, b, traza de color púrpura claro). Sin embargo, después del entrenamiento multisensorial, el olor CS+ produjo una despolarización significativa de los axones γd KC en el compartimento γ5 (Fig. 3a, traza de color púrpura oscuro). Las respuestas de CS+ en el compartimento γ1 parecían menos inhibitorias que las de CS− (Fig. 3b; aunque las respuestas eran estadísticamente indistinguibles), quizás debido a que los DAN de PPL1-γ1pedc estaban modulados por el estado de hambre de la mosca29,30. La reversión del signo impulsada por el entrenamiento multisensorial de la respuesta de olor γd KC en γ5 no ocurrió después del entrenamiento unisensorial solo de olor (Fig. 3c, trazo morado oscuro) o entrenamiento no emparejado (Datos extendidos Fig. 3a, trazo morado oscuro). En estos casos, los olores de CS+ y CS- provocaron hiperpolarización en los compartimentos γ1 y γ5 (Fig. 3c, d y Datos extendidos Fig. 3a, b). Las imágenes de señales evocadas por colores revelaron fuertes respuestas a ambos colores en γd KCs de moscas ingenuas (Datos extendidos Fig. 3c). El registro de los KC de γm reveló una ganancia de excitación restringida por el compartimento γ5 pronunciada por el color CS + después del entrenamiento multisensorial, sin alteración de las respuestas en el compartimento γ1 (Fig. 3e, f; tenga en cuenta que la detección de imágenes de escaneo láser está bloqueada por un obturador durante presentación de color). La luz de color pulsante que se requiere para estos experimentos de imágenes no afectó el aprendizaje multisensorial y la recuperación visual (datos extendidos Fig. 3d, e) o las respuestas de γm KC a los olores (datos extendidos Fig. 3h, i). Estos resultados indican que las señales de enseñanza de recompensa dopaminérgica amplían la excitación CS+ evocada por olor y CS+ evocada por color dentro del conjunto γ-KC al reclutar los segmentos γ5 de los axones γd KC para que se activen por olor y γm por color (Fig. 3g). Estos engramas de memoria de color y olor más grandes proporcionan un mecanismo de cómo se mejora el rendimiento de la memoria de olor y color después del entrenamiento multisensorial (Fig. 1e, f), y explica por qué la recuperación de la memoria de olor en este contexto adquiere un requisito para la salida γd KC (Fig. 2e ).

En los paneles a–f, líneas de tiempo para el entrenamiento multisensorial apetitivo (color + olor) o unisensorial apetitivo (olor) seguido de imágenes de respuesta de olor o color (arriba a la izquierda); plano de imagen en la región γ5 o γ1 de los axones KC γd o γm (abajo a la izquierda); rastros de CS+ y CS− actividad evocada por olores (centro); y se muestra la cuantificación de las respuestas (derecha). a, la región γ5 de los axones γd KC mostró una respuesta excitatoria al olor CS+ (una disminución en la fluorescencia aumenta el –ΔF/F0 del sensor de voltaje ASAP2f) después del entrenamiento multisensorial. Los axones γ5 fueron inhibidos por el olor CS− (disminución de −ΔF/F0). b, No se observaron respuestas excitatorias al olor de CS+ en γ1 y el olor de CS− provocó inhibición. c, d, las regiones γ5 (c) y γ1 (d) mostraron inhibición de los olores CS+ y CS− después del entrenamiento apetitivo unisensorial (olor). e, la región γ5 de los axones γm KC mostró una respuesta excitatoria solo al color CS+ después del entrenamiento multisensorial. f, No se observó excitación al color CS+ en γ1. Para todos los rastros y cuantificaciones en este estudio, los datos de CS+ corresponden a respuestas promedio en las que la mitad de los ensayos usaron azul o MCH como CS+ y la otra mitad usó verde u OCT como CS+. Lo mismo se aplica a los datos CS−. Los rastros de actividad evocados por olores o colores muestran la media (línea continua) con sem (sombra). Las líneas discontinuas horizontales indican la actividad de referencia. En a–d, la línea negra continua debajo de los trazos marca una exposición al olor de 5 s. En e y f, la barra gris vertical corresponde a la presentación en color de 0,75 s cuando la adquisición de imágenes está cerrada y el cuadro punteado corresponde al período de cuantificación de 1,75 s. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre las respuestas CS+ y CS− promediadas (P < 0,05). Las respuestas CS+ y CS− para cada mosca están conectadas por una línea discontinua. Todos los grupos se compararon mediante la prueba t de dos caras pareadas; los valores P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. n = 26 moscas (a,b); n = 24 moscas (c); n = 22 moscas (d); yn = 16 moscas (e,f). g, modelo MB para entrenamiento apetitivo multisensorial de color + olor seguido de prueba unisensorial de olor o color. Los KC γm reciben información olfativa dendrítica y información visual γd. Ambos tipos de γ-KC proyectan axones a través de los compartimentos γ1–γ5 del lóbulo γ MB. El entrenamiento apetitivo (izquierda) involucra DAN de recompensa (verde) que inervan γ4 y γ5, cuya dopamina liberada codifica el aprendizaje al deprimir las sinapsis49 entre los KC activados por olores y las neuronas de salida de MB que dirigen la evitación (no ilustradas)14. La señalización de dopamina durante el aprendizaje multisensorial también se une a la actividad de KC γm y γd en los compartimentos γ4–γ5. Durante futuras pruebas de olor unisensoriales (centro), el olor CS+ excita KC γm específicos (flecha gris gruesa), que a su vez activan los axones γd en los compartimentos γ4–γ5 (líneas discontinuas grises a amarillas). La activación inversa mediada por γd de los KC γm se produce con pruebas de color unisensoriales (derecha).

Las imágenes de voltaje de los somas γd KC no mostraron la activación del olor después del entrenamiento de recompensa multisensorial (Datos extendidos Fig. 3f, g), lo que sugiere que el reclutamiento impulsado por el aprendizaje de estas neuronas para que respondan al olor no ocurre al mejorar la entrada dendrítica. Por lo tanto, probamos más un modelo de reclutamiento axonal. Razonamos que si los DAN dirigen el reclutamiento de axones γd para que se activen con el olor (y los axones γm para que se activen con el color), un evento de aprendizaje aversivo que requiere la liberación de dopamina de los DAN PPL1-γ1pedc que inervan el compartimento del lóbulo γ1 más proximal31 debería conferir olor capacidad de respuesta en todos los segmentos de axón γd corriente abajo desde γ1 a γ5. Confirmamos que el entrenamiento multisensorial de aversión al color y al olor (descarga eléctrica) produjo una mejora de la memoria para las señales combinadas e individuales, similar a la observada después del entrenamiento apetitivo (Datos extendidos, Fig. 4a-f), y que también se requerían KC γd para la memoria del olor. mejora después del entrenamiento multisensorial aversivo (datos extendidos Fig. 4g-l). A continuación, utilizamos imágenes de voltaje de dos fotones para probar si los axones γd de γ1 en adelante ganaron activación de olor CS + después del aprendizaje aversivo multisensorial. La presentación del olor de CS− evocó la hiperpolarización de los KC γd en los compartimentos γ1 y γ5, independientemente del protocolo de entrenamiento (Fig. 4a, b y Datos extendidos Fig. 4m–p, traza de color púrpura claro). Por el contrario, después del entrenamiento aversivo multisensorial, el olor CS + produjo una breve excitación de los KC γd en γ1 y γ5 (Fig. 4a, b, traza de color púrpura oscuro). Los registros de las respuestas de olor en los KC γd después del aprendizaje multisensorial apetitivo y aversivo, y de los KC γm provocados por el color después del aprendizaje multisensorial apetitivo, son consistentes con la ubicación de las señales de enseñanza de DAN que determinan la porción de un axón γ-KC que gana activación por el otra modalidad CS+. Mientras que el aprendizaje aversivo hace que todos los segmentos del axón aguas abajo de γ1 sean excitables por la modalidad recíproca (Fig. 4c), el aprendizaje de recompensa altera principalmente la excitación CS+ dentro de los segmentos γ4 y γ5 (Fig. 3g).

a,b, Entrenamiento multisensorial aversivo (color + olor) y líneas de tiempo de imágenes de olores (arriba a la izquierda). El plano de imagen en la región γ1 (a) o γ5 (b) de los axones γd KC (extremo inferior izquierdo). Rastros de CS+ y CS− actividad evocada por olores (centro). Cuantificación de respuestas evocadas por olores (derecha). La región γ1 mostró excitación al olor CS+ e inhibición al olor CS− después del entrenamiento multisensorial aversivo (a). El olor CS+ evocó menos inhibición en γ1 que CS− (b). Los rastros de actividad provocados por olores muestran la media (línea continua) con sem (sombra). Las líneas discontinuas horizontales indican la actividad de referencia. La línea negra sólida debajo de los rastros marca una exposición al olor de 5 s. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre las respuestas CS+ y CS− promediadas (P < 0,05). Las respuestas CS+ y CS− para cada mosca están conectadas por una línea discontinua. c, modelo MB para entrenamiento multisensorial aversivo seguido de prueba de olor. El entrenamiento multisensorial aversivo (izquierda) activa los DAN de castigo (rojo) que deprimen las sinapsis16,17 entre los KC γm y γd y las neuronas de salida MB γ1 y γ2 que dirigen la aproximación16,17 (no se muestra), mientras que también une la actividad de KC γd y γm en estos compartimentos. La prueba de olor unisensorial (derecha) excita KC γm específicos, que activan los axones γd desde γ1 hacia adelante. d,e, el aprendizaje multisensorial aversivo anterior mejora el aprendizaje apetitivo futuro pero no el olor aversivo. Se muestran los protocolos (izquierda). Las moscas hambrientas se dividieron en entrenamiento multisensorial aversivo (grupo I) y entrenamiento de olor unisensorial aversivo (grupo II). Tres horas más tarde, ambos grupos fueron entrenados con olores y recompensa de azúcar (usando los mismos olores CS+ o CS− que para el entrenamiento inicial) y evaluados inmediatamente después. También se muestra el rendimiento de la memoria (derecha). El grupo I entrenado inicialmente con el protocolo aversivo multisensorial se desempeñó mejor que el grupo II entrenado inicialmente solo con olores (d). El grupo I entrenado inicialmente con el protocolo apetitivo multisensorial no superó al grupo II entrenado inicialmente solo con olores (e). Los asteriscos indican diferencias significativas (P < 0,05). Los datos se presentan como media ± sem Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. Los grupos se compararon mediante la prueba t de dos caras pareadas (a, b) y la prueba t de dos caras no pareadas (d, e); los valores P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. n = 24 moscas (a,b), n = 12 (d) y n = 8 (e).

Se podría esperar que una expansión de la representación del olor CS+ en un segmento particular de los axones γd después del entrenamiento multisensorial facilite el aprendizaje posterior con el mismo olor, si la siguiente señal de enseñanza DAN se cruza con la representación KC expandida. Probamos esta noción entrenando secuencialmente moscas con un protocolo multisensorial aversivo (dopamina en γ1) o apetitivo (dopamina en γ4 y γ5) seguido de aprendizaje unisensorial de recompensa de olor o castigo de olor (Fig. 4f, g). El entrenamiento aversivo multisensorial anterior mejoró significativamente el aprendizaje posterior de recompensa por olores (Fig. 4d). Sin embargo, no fue evidente ninguna mejora si el aprendizaje de olores aversivos siguió al aprendizaje apetitivo multisensorial (Fig. 4e). Por lo tanto, la expansión dependiente del entrenamiento multisensorial de la representación del olor CS+ puede incluirse en el siguiente engrama de memoria del olor CS+ si los segmentos de axón γd apropiados se han activado con el olor CS+.

La anatomía de la red MB sugiere dos formas posibles de conferir respuesta al olor a los axones γd KC: a través de sinapsis KC-KC o neuronas posicionadas para unir las diferentes corrientes KC. Consultamos la viabilidad anatómica de estas rutas utilizando el conectoma MB completo de un solo volumen de microscopio electrónico de mosca hembra adulta 'hemibrain'32,33. Aunque la mayoría (562 de 590) los KC γm hacen sinapsis con los KC γd, el número y la ubicación de estas conexiones no admiten que todos los KC γd reciban la entrada γm en cada compartimento del lóbulo γ. Además, se informó que las conexiones KC-KC suprimen la actividad en los KC vecinos34. A continuación, estudiamos la anatomía fina de la inervación del lóbulo γ de la neurona medial emparejada dorsal (DPM) serotoninérgica potencialmente excitatoria en el volumen del microscopio electrónico del hemicerebro. Las neuronas DPM envían ramas separadas que inervan densamente los lóbulos verticales y horizontales y el pedúnculo distal de la MB, donde son tanto presinápticas como postsinápticas para los KC35,36,37. La ultraestructura de las proyecciones neuronales de DPM en el lóbulo γ reveló dos ramas dentro de γ1 y otras ramas ventrales y dorsales que pasan a través de los compartimentos γ2–γ5 (Fig. 5a). Las posiciones de las sinapsis neuronales DPM en los KC γd siguen el haz de axones γd KC a medida que se enrolla alrededor del lóbulo γ desde ventral en el compartimento γ1 hasta dorsal en el compartimento γ5 (Fig. 5a).

a, representación 3D de MB (gris claro) con neuritas del lóbulo γ de la neurona DPM (verde azulado) (izquierda). DPM se trifurca (asterisco) en ramas dorsales (verde azulado oscuro), ventrales (verde azulado claro) y compartimento γ1 (verde azulado). Las neuritas se sombrearon según el orden de Strahler, y las ramitas con orden de Strahler menor que 1 se podaron. Se muestran los detalles del lóbulo γ con los bordes del compartimento γ1–γ5 (líneas discontinuas) (derecha). Las presinapsis de DPM con γd KC (esferas amarillas) se colocalizan en la rama dorsal de DPM en γ5. Las sinapsis de entrada de γm KC (esferas grises) a DPM se encuentran a lo largo de las ramas ventral y dorsal. En γ5, 450 de 585 γm KC hicieron sinapsis con la rama dorsal de DPM, donde 89 de 98 γd KC también recibieron entrada de DPM. Las entradas neuronales de APL (esferas magenta) se localizan a lo largo de ambas ramas de DPM. b, proyección de dendrograma 2D de neuritas DPM (tonos de verde azulado; consulte Datos extendidos Fig. 5a para obtener más detalles). El compartimento γ1 está marcado y los compartimentos γ2–γ5 están divididos entre las ramas neuronales DPM dorsal y ventral. Las entradas de los KC γm (esferas grises) y las salidas de los KC γd (esferas amarillas) se colocalizan en ramas específicas del compartimento. Las entradas inhibitorias de la neurona APL (esferas magenta) se distribuyen a través de las neuritas DPM. La conectividad APL se detalla en Datos extendidos Fig. 5b. c, d, esquema de la neurona DPM (c; arriba). También se muestra la línea de tiempo con el cambio de temperatura (línea discontinua). Se muestra el bloqueo de la salida de las neuronas DPM con VT64246-GAL4;UAS-Shits1 durante el entrenamiento (c) o la prueba (d) del rendimiento de recuperación olfativa de 6 h (abajo). e,f, Entrenamiento multisensorial apetitivo (color + olor) y cronogramas de imágenes de olores para neuronas DPM (izquierda). Se muestran los planos de imagen en las regiones γ5 (e) y γ1 (f) de las neuronas DPM y los rastros de la actividad provocada por el olor CS+ y CS− (centro). Se muestra la cuantificación de las respuestas (derecha). Las regiones γ5 y γ1 de DPM mostraron respuestas excitatorias a los olores CS+ y CS−, pero las respuestas CS+ solo mejoraron específicamente en γ5. g, Línea de tiempo (izquierda). Eliminación de ARNi de 5-HT2A, pero no de 5-HT2B o 5-HT7, receptores en γd KC con MB607B-GAL4 rendimiento de recuperación olfativo deteriorado después del entrenamiento multisensorial. En c, d, g, los datos se representan como media ± sem, los puntos de datos individuales se muestran como puntos y los asteriscos indican una diferencia significativa (P < 0,05). Bkg, fondo de ARNi. h, Cronología del entrenamiento multisensorial apetitivo y de imágenes de olores (arriba a la izquierda). El plano de imagen en γ5 de los axones γd KC (extremo inferior izquierdo). Rastros de CS+ y CS− actividad evocada por olores (centro). 5HT2AR-RNAi eliminó la excitación evocada por ganancia de olor en γ5 de γd KC después del entrenamiento multisensorial (ver también Fig. 3a); Los olores CS+ y CS− inhibieron de manera similar los axones γd KC. También se muestra la cuantificación (derecha). Los rastros de actividad provocados por olores muestran la media (línea continua) con sem (sombra). Las líneas discontinuas horizontales indican la actividad de referencia.La línea negra sólida debajo de los rastros marca una exposición al olor de 5 segundos. El asterisco en e indica una diferencia significativa entre las respuestas CS+ y CS− promediadas (P < 0,05). Las respuestas CS+ y CS− para cada mosca están conectadas por líneas discontinuas. Los grupos se compararon usando ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey (c, d), prueba t de dos caras pareadas (e, f, h) y ANOVA unidireccional con la prueba de Dunnett (g); los valores P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. n = 8 para Shi y n = 9 para otros grupos (c); n = 10 (d, g); n = 26 moscas (e,f); y n = 24 moscas (h). Ver datos extendidos Fig. 7 para controles. i, Modelo de puente de microcircuito DPM de KC específicos de olores y colores después del aprendizaje multisensorial.

Anotando un dendrograma de neuritas DPM (Fig. 5b) con límites de compartimiento de lóbulo γ (basado en la conectividad DAN), sinapsis de γm KC y aquellos a γd KC, mostró que ramas únicas de la neurona DPM pueden proporcionar puentes de microcircuitos específicos del compartimiento entre γm y γd KC. Las neuronas DPM también pueden unir γd a γm KC (datos extendidos Fig. 5a). Se descubrió que la gran neurona GABAérgica lateral anterior emparejada (APL) 38 hace sinapsis a lo largo de las ramas DPM en el lóbulo γ (Fig. 5b y Datos extendidos Fig. 5a), lo que sugiere que el puente DPM puede regularse por inhibición local. La neurona APL recibe muchas entradas de DAN dentro de cada compartimento y, por lo tanto, también puede regularse con especificidad de región39 (datos extendidos, figura 5b), para liberar potencialmente ramas específicas de DPM de la inhibición de APL.

Desafiamos este supuesto modelo de puente de microcircuito mediante la manipulación independiente de las neuronas APL y DPM. La expresión en las neuronas APL del receptor de dopamina DopR2 se ha relacionado con el aprendizaje aversivo40, y el perfil transcripcional ha sugerido que las neuronas APL también expresan el receptor DopEcR41. Se sabe que ambos receptores de dopamina tienen una acción inhibitoria42,43. Por lo tanto, utilizamos tubP-GAL80ts (ref. 44) para restringir temporalmente el ARNi transgénico en las neuronas APL para probar el papel de estos receptores en el aprendizaje multisensorial. Derribar Dop2R en neuronas APL adultas eliminó la mejora multisensorial del rendimiento de recuperación olfativa (Datos extendidos Fig. 6a, c). También se observó un defecto leve en la memoria del olor después del condicionamiento del apetito olfativo; sin embargo, la diferencia solo fue significativa para un control (Datos extendidos Fig. 6b, d). Por el contrario, DopEcR RNAi no tuvo efecto en ninguno de los experimentos (Datos extendidos Fig. 6e, f). Estos resultados son consistentes con el refuerzo de las neuronas APL que inhiben la dopamina para permitir el reclutamiento de γd KC en el engrama de memoria olfativa durante el aprendizaje multisensorial.

Probamos un papel para las neuronas DPM serotoninérgicas usando la expresión de UAS-Shits1. La restricción temporal de la transmisión de las neuronas DPM, ya sea durante la adquisición (Fig. 5c y Datos extendidos Fig. 7a) o la recuperación (Fig. 5d y Datos extendidos Fig. 7a) perjudicó significativamente la mejora del entrenamiento multisensorial de la memoria de recuperación de olores. El bloqueo de la salida neuronal DPM también perjudicó la recuperación de la memoria visual después del aprendizaje multisensorial (Datos extendidos Fig. 7b). Estas mismas manipulaciones no tuvieron efecto sobre la memoria del olor después del aprendizaje olfativo unisensorial (Datos ampliados Fig. 7c), como en un estudio previo45. Estos datos son consistentes con que se requiere salida neuronal DPM durante el aprendizaje para unir flujos de KC activos simultáneamente, mientras que la salida neuronal DPM durante la recuperación de la memoria proporciona la conexión para que los KC γm impulsados ​​por olores activen los KC γd relevantes.

A continuación, realizamos experimentos fisiológicos y de comportamiento para probar directamente un modelo en el que el aprendizaje multisensorial establece un puente de microcircuito de neuronas DPM excitatorias entre los KC olfativos γm y γd visuales. Primero usamos UAS-Shits1 para determinar si se requería una salida de γ-KC (γm y γd) durante el entrenamiento para mejorar la recuperación de la memoria olfativa y visual después del entrenamiento multisensorial. Mientras que el bloqueo de los γ-KC durante el aprendizaje multisensorial perjudicó significativamente tanto la recuperación olfativa como la visual (Datos ampliados Fig. 7e-h), no alteró el aprendizaje olfativo (Datos ampliados Fig. 7d), como en estudios anteriores46,47,48. Encontrar que la plasticidad de la red de la memoria multisensorial requiere una salida de KC sugiere que implica reglas de aprendizaje diferentes a las de la memoria olfativa unisensorial16,49.

Utilizamos UAS-ASAP2f para buscar la plasticidad específica del compartimento de la conectividad funcional de las neuronas DPM después del aprendizaje de recompensa multisensorial. Se demostró que el aprendizaje de recompensa olfativa aumenta específicamente las respuestas de calcio en las neuronas DPM al olor CS + durante hasta 2,5 h (refs. 36, 50) (ver registros de voltaje de 1 h; datos extendidos Fig. 7k-l). El registro 6 h después del entrenamiento multisensorial reveló un aumento claro y específico de las respuestas de voltaje de olor CS + en las proyecciones de DPM en el compartimento γ5, pero no en el γ1 (Fig. 5e, f), que estaba ausente en este momento después del aprendizaje olfativo (Datos extendidos Fig. 7i, j). Esto sugiere que el aprendizaje de recompensa multisensorial potencia las sinapsis de los KC γm específicos del olor CS+ a las neuronas DPM dentro del microcircuito del compartimento γ5 de la MB. Como nuestras imágenes previas de los KC γd mostraron que también se activan con el olor CS+ en sus segmentos γ5 después del aprendizaje de recompensa multisensorial (Fig. 3a), probamos si la capacidad de respuesta al olor de la ganancia de γd podría estar mediada por la serotonina liberada por las neuronas DPM (5 -hidroxitriptamina (5-HT)). Primero establecimos que la aplicación de baño de 5-HT (en presencia de tetrodoxina para bloquear la activación indirecta a través de otras neuronas) provocó directamente la despolarización de γd KC que expresan UAS-ASAP2f en moscas ingenuas (Datos extendidos Fig. 7o, p). La 5-HT puede ejercer efectos excitadores a través de los receptores de tipo 5-HT2A y 5-HT751. Por lo tanto, usamos RNAi para eliminar estos receptores en γd KC. La reducción de la expresión del receptor de 5-HT2A, pero no de 5-HT7 o 5-HT2B, afectó el rendimiento de la memoria olfativa después del entrenamiento multisensorial (Fig. 5g), pero no el entrenamiento olfativo (Datos extendidos, Fig. 7q). Además, la coexpresión de 5-HT2A RNAi con UAS-ASAP2f en γd KC eliminó la activación del olor de CS+ inducida por el aprendizaje multisensorial en la región γ5 de γd KC (Fig. 5h), pero no afectó el color evocado. respuestas (Datos extendidos Fig. 7r). Juntos, estos datos anatómicos, genéticos y fisiológicos nos llevan a concluir que la dopamina específica del compartimento provocada por el reforzador libera inhibición mediada por APL, lo que facilita que la misma dopamina de refuerzo induzca la plasticidad KC-DPM y DPM-KC que forma un olor-color serotoninérgico excitador. -Puentes de microcircuitos DPM específicos entre los KC relevantes γm y γd (Fig. 5i), y probablemente viceversa.

Nuestro estudio describe un mecanismo neuronal preciso en Drosophila a través del cual el aprendizaje multisensorial mejora el rendimiento de la memoria posterior, incluso para señales sensoriales individuales. Una única prueba de entrenamiento con señales visuales solo podría generar un rendimiento sólido de la memoria si se combinaran con olores durante el entrenamiento, de forma similar al aprendizaje de la percepción del ritmo visual en humanos, que requiere información auditiva de acompañamiento52. Mostramos que el aprendizaje multisensorial une información de olores y colores temporalmente contingentes dentro de los axones de MB γ-KC, a través de neuronas DPM serotoninérgicas, cuya actividad también define la ventana de tiempo de coincidencia53. Esta unión impulsada por el aprendizaje convierte los axones de KC selectivos visualmente (presumiblemente de color) para que también respondan al olor entrenado temporalmente contingente. También demostramos que los axones de los KC selectivos olfativos se activan por el color entrenado temporalmente contingente. Aunque la entrada dendrítica predominante define a los KC γm como olfativos y γd como visuales, nuestras grabaciones mostraron que los segmentos de sus axones se vuelven multimodales después del aprendizaje multisensorial. Este resultado sugiere que los γ-KC son un sustrato probable donde se puede integrar otra información sensorial temporalmente contingente con la de señales sensoriales explícitas54,55.

Aunque nuestros experimentos se centraron principalmente en los KC γm activados por olores que reclutan KC γd de color a través de microcircuitos DPM, la mejora conductual observada de la memoria visual después del aprendizaje multisensorial, la demostración de que los KC γm responden al color entrenado y la conectividad recíproca de las neuronas DPM sugieren que las neuronas DPM probablemente también medien un puente de polaridad inversa. Al hacerlo, el aprendizaje multisensorial utiliza las neuronas DPM para vincular los KC que responden a cada señal sensorial temporalmente contingente y expande las representaciones de cada señal en la de la otra. Esta expansión multimodal permite que la experiencia multisensorial se recupere de manera eficiente mediante señales combinadas y cada una de ellas individualmente. Como resultado, las moscas entrenadas pueden evocar el recuerdo de una experiencia visual con el olor aprendido y el recuerdo de un olor con el color aprendido. Estos hallazgos proporcionan un mecanismo neuronal a través del cual la mosca logra un equivalente conceptual de la finalización del patrón dependiente del hipocampo en los mamíferos, en el que las escenas parciales pueden recuperar una representación de la memoria más completa56. Los pacientes humanos con esquizofrenia y autismo presentan deficiencias en la integración multisensorial57, y estas condiciones se han relacionado con la disfunción serotoninérgica y los receptores 5-HT2A58. Nuestro trabajo aquí sugiere que el enrutamiento inadecuado de las percepciones multisensoriales puede contribuir a estas condiciones. Además, los receptores excitadores 5-HT2A que median la unión multisensorial son los principales objetivos de las drogas alucinógenas59.

Todas las cepas de Drosophila melanogaster se criaron a 25 °C y entre 40 y 50 % de humedad, excepto donde se indique lo contrario, con alimentos estándar de agar y harina de maíz (100 g l-1 de d-glucosa anhidra, 47,27 g l-1 de harina de maíz orgánica, 25 g l-1 de agar autolizado). levadura, 7,18 g l−1 de agar y 12,18 g de Tegosept disueltos en 8,36 ml de etanol absoluto, por litro de alimento para moscas) en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h. Las moscas Canton-S se utilizaron como tipo salvaje (WT) y se originaron en el laboratorio de William Quinn (Instituto de Tecnología de Massachusetts, Cambridge, MA, EE. UU.). Las siguientes líneas GAL4 se utilizaron en los experimentos de comportamiento: MB607B-GAL4 (refs. 13,60), MB009B-GAL4 (refs. 13,60), c708a-GAL4 (ref. 61), VT43924-GAL4.2 (ref. 39) y VT64246-GAL4 (ref. 62). El bloqueo de la salida neuronal controlado por temperatura se logró expresando el transgén UAS-Shits1 (ref. 21) bajo el control de MB607B-GAL4 (refs. 13,60), MB009B-GAL4 (refs. 13,60), c708a- Controladores GAL4 (ref. 61) y VT64246-GAL4 (ref. 62). Para los experimentos de eliminación de ARNi que involucran APL, se cruzaron moscas tubP-GAL80ts (ref. 44), VT43924-GAL4.2 (ref. 39) con moscas UAS-Dop2R RNAi63 y UAS-DopEcR RNAi (VDRC ID: 103494). La misma línea conductora se cruzó con moscas WT y la cepa de fondo de ARNi (VDRC ID: 60100), como controles. Para los experimentos de eliminación de ARNi que involucran γd KC, se cruzaron moscas MB607B-GAL4 (refs. 13,60) con UAS-5-HT2A RNAi (31882, BDSC), UAS-5-HT2B RNAi (60488, BDSC) y UAS-5- Moscas HT7 RNAi (27273, BDSC). La misma línea conductora se cruzó con la cepa de fondo de ARNi (36304, BDSC), como controles. Para experimentos de imágenes en vivo, UAS-ASAP2f64 se expresó utilizando MB607B-GAL4 (refs. 13,60) y VT64246-GAL4 (ref. 62) y UAS-ASAP2s65 con la línea de controlador 1471-GAL4 (ref. 66). Utilizamos moscas macho y hembra para los experimentos de imagen y comportamiento.

Las moscas macho de las líneas GAL4 se cruzaron con hembras vírgenes UAS-Shits1, excepto en los experimentos con c708a-GAL4, en los que se cruzaron machos UAS-Shits1 con hembras vírgenes c708a-GAL4. Para los controles heterocigotos, las moscas GAL4 o UAS-Shits1 se cruzaron con moscas WT. En los experimentos de ARNi, las moscas GAL4 o ARNi se cruzaron con las cepas de fondo de ARNi apropiadas o moscas WT, respectivamente. Todas las moscas se criaron a 25 °C, excepto cuando se indica a continuación para la manipulación de la expresión de ARNi. En todos los experimentos se utilizaron poblaciones de moscas de 2 a 8 días de edad.

Para los experimentos de acondicionamiento del apetito, se colocaron de 80 a 100 moscas en un vial de 25 ml que contenía agar al 1 % (como fuente de agua) y un trozo de papel de filtro de 20 × 60 mm durante 19 a 22 h antes del entrenamiento y se las mantuvo privadas de alimento durante todo el experimento, excepto cuando se analizó la memoria de 24 h en la que las moscas se alimentaron durante 30 minutos después del entrenamiento y luego regresaron a los viales de inanición hasta la prueba. Para los experimentos de condicionamiento aversivo, se colocaron de 80 a 100 moscas en un vial que contenía alimento estándar y un trozo de papel de filtro durante 14 a 22 h antes de los experimentos de comportamiento.

Para los experimentos que involucran el bloqueo neuronal con UAS-Shits1, en cada figura se proporciona un esquema de la línea de tiempo del cambio de temperatura. Para los experimentos Shits1, las moscas se transfirieron a una temperatura restrictiva de 33 °C durante 30 minutos antes del entrenamiento y/o la prueba. Para los experimentos de ARNi que involucran tubP-GAL80ts;VT43924-GAL4.2, las moscas se criaron a 18 °C y se cambiaron a 29 °C después de la eclosión para inducir la expresión de ARNi durante 3 días antes de los experimentos de comportamiento. Las moscas permanecieron a 29 °C durante la duración de los experimentos.

Todos los experimentos de comportamiento se realizaron utilizando un laberinto en T estándar que se modificó para permitir la entrega simultánea de estímulos de color y olor. El laberinto en T, que está hecho de plástico translúcido, se cubrió con una película opaca para minimizar la interferencia entre los estímulos visuales cuando se usaban en paralelo. Los olores se diluyeron en MCH y OCT en aceite mineral (a una dilución de aproximadamente 1:10-3). Los colores fueron proporcionados por diodos emisores de luz (LED); LED verdes con una longitud de onda de 530 ± 10 nm (PM2E-3LGE-SD, ProLight Opto) y LED azules con una longitud de onda de 465 ± 10 nm (PM2B-3LDE-SD, ProLight Opto). Se ensamblaron cuatro LED en un circuito integrado en un disipador de calor y se montaron de forma segura en la parte superior de los tubos de distribución de olores. Las intensidades de los LED se ajustaron para que las moscas ingenuas no mostraran preferencia fototáctica entre los brazos del laberinto en T iluminados. Los estímulos visuales se presentaron de la misma manera y con la misma intensidad tanto para el entrenamiento como para la prueba. Para experimentos apetitosos, los tubos de ensayo se recubrieron con papel de filtro; para experimentos aversivos, los tubos de ensayo estaban revestidos con rejillas de choque no electrificadas. Los experimentos se realizaron en una cámara ambiental ajustada a la temperatura deseada y una humedad relativa del 55 al 65 %. Las moscas se manipularon antes del entrenamiento y las pruebas bajo una luz roja cenital.

El condicionamiento apetitivo se realizó esencialmente como se describió previamente67. En resumen, las moscas fueron expuestas durante 2 min a estímulos Y (YColor y/o YOdor) sin refuerzo en un tubo con papel de filtro seco (CS−), 30 s de aire limpio, luego 2 min con estímulos X (XColor y/o XOdour) presentado con sacarosa 5,8 M secada en papel de filtro (CS+). Para el condicionamiento olfativo aversivo17,18, las moscas recibieron 1 minuto de exposición a estímulos X (XColor y/o XOlor) junto con doce descargas eléctricas de 90 V a intervalos de 5 s (CS+), 45 s de aire limpio, seguido de 1- min exposición a estímulos Y (YColor y/o YOolor) sin refuerzo (CS−). Las descargas eléctricas se administraron utilizando un estimulador de pulso cuadrado Grass S48 (Tecnología Grass). Las rejillas de choque fueron las descritas anteriormente68 y consisten en filas de cobre intercaladas impresas en una película de Mylar transparente, que permite el paso de la luz de color.

El rendimiento de la memoria se evaluó analizando la preferencia de las moscas entre los colores y/u olores CS− y CS+ durante 2 min. La prueba de olor se realizó en la oscuridad. Las moscas de cada brazo se recogieron y se transfirieron a tubos de poliestireno (tubo de ensayo de polipropileno de fondo redondo con tapa de 14 ml, Falcon). Los tubos con moscas se congelaron a -20 °C y luego se retiraron las moscas y se contaron manualmente.

Los índices de rendimiento se calcularon como el número de moscas en el brazo CS+ menos el número en el brazo CS−, dividido por el número total de moscas. Para todos los experimentos de comportamiento, una sola muestra, o n, representa el índice de rendimiento promedio de dos grupos independientes de moscas entrenadas con las combinaciones recíprocas de color y olor como CS+ y CS−. El n total para cada experimento se adquirió en tres sesiones de entrenamiento diferentes en días diferentes.

Se utilizaron seis protocolos de comportamiento:

Aprendizaje visual: los colores (XColour e YColour) se utilizaron como CS+ y CS−.

Aprendizaje olfativo: los olores (XOdour y YOdour) se utilizaron como CS+ y CS−.

Protocolo congruente: se combinaron colores y olores (XColour + XOdour e YColour + YOdour) como CS+ y CS−. Se usaron las mismas combinaciones de colores y olores durante el entrenamiento y las pruebas.

Protocolo incongruente: las contingencias de estímulo de color y olor se cambiaron entre entrenamiento (XColor + YOdour e YColour + XOdour) y prueba (XColour + XOdour e YColour + YOdour).

Los protocolos de aprendizaje visual y olfativo son unisensoriales, mientras que los protocolos congruentes e incongruentes son multisensoriales.

Recuperación olfativa: las moscas se entrenaron como en el protocolo congruente, pero solo los olores (XOdour y YOdour) se presentaron como elección en la prueba.

Recuperación visual: las moscas se entrenaron como en el protocolo congruente, pero solo los colores (XColour e YColour) se presentaron como elección en la prueba.

Los experimentos de aprendizaje secuencial representados en la Fig. 4f, g utilizaron entrenamiento multisensorial congruente aversivo o apetitivo seguido de aprendizaje olfativo unisensorial apetitivo o aversivo, y luego probaron con recuperación olfativa.

Todas las moscas se criaron a 25 °C y en todos los experimentos se utilizaron moscas macho y hembra de 3 a 8 días de edad. Los experimentos de formación de imágenes se realizaron esencialmente como se describió anteriormente69,70,71. En resumen, las moscas se entrenaron en la configuración del laberinto en T utilizando el aprendizaje olfativo (protocolo 2), un protocolo multisensorial congruente (protocolo 3) o un protocolo de entrenamiento no emparejado. En el entrenamiento no apareado, las moscas fueron expuestas a los estímulos visuales y de olor combinados (XColor + XOlor y combinación de YColor + YOdoro), pero el choque o el azúcar se presentaron solos 2 min antes o después del CS+, respectivamente. Después del entrenamiento, las moscas se mantuvieron en la oscuridad hasta el momento del registro. Justo antes de la grabación, las moscas se inmovilizaron brevemente en hielo y se montaron en una cámara hecha a medida que permitía el libre movimiento de las antenas y las patas. La cápsula de la cabeza se abrió bajo una solución tampón carbogenada (95% O2 y 5% CO2) a temperatura ambiente, y la mosca, en la cámara de registro, se colocó bajo un microscopio de dos fotones (Scientifica). Para las moscas hambrientas, se utilizó el siguiente tampón sin azúcar: NaCl 108 mM, KCl 5 mM, HEPES 5 mM, ribosa 15 mM, NaHCO3 4 mM, NaH2PO4 1 mM, CaCl2 2 mM y MgCl2 8,2 mM, osmolaridad 272 mOsm, pH 7.3). Para las moscas alimentadas, se utilizó el siguiente tampón: NaCl 103 mM, KCl 3 mM, N-Tris 5 mM, trehalosa 10 mM, glucosa 10 mM, sacarosa 7 mM, NaHCO3 26 mM, NaH2PO4 1 mM, CaCl2 1,5 mM y MgCl2 4 mM , osmolaridad 275 mOsm, pH 7,3).

Las moscas se sometieron a una corriente de aire constante, que transportaba vapor del solvente de aceite mineral (aire). Para los experimentos de imágenes evocados por olores, las moscas se expusieron secuencialmente a olores CS+ y CS−, cada uno durante 5 s, intercalados por 30 s, para simular la prueba de comportamiento. Al igual que en los experimentos de comportamiento, los olores fueron MCH y OCT (diluidos en aceite mineral a aproximadamente 1:10−3), y se utilizaron recíprocamente como CS+ y CS−. Las moscas que no respondieron a uno de los dos olores presentados se excluyeron de análisis posteriores. Para los experimentos de imágenes evocados por colores, la presentación del color se intercaló con la adquisición de imágenes. Esto se logró usando un obturador en el objetivo (obturador de haz óptico con diafragma de acero inoxidable de Ø1/2" con controlador, Thorlabs) y un segundo obturador controlado externamente (Vincent/UniBlitz VS35S2ZM1R1-21 Uni-Stable Shutter; UniBlitz VMM-T1 Shutter Driver/ Timer Controller) en el sistema de entrega de LED. Para cada ciclo de grabación, el color se presentó durante 0,75 s a 0,4 Hz y seguido de la adquisición de imágenes durante 1,75 s. Es importante destacar que la presentación de color pulsado de 0,4 Hz evocó respuestas robustas en γd KCs en moscas ingenuas , medido con UAS-ASAP2f (datos extendidos Fig. 4h), y las pruebas de memoria de comportamiento con colores parpadeantes de 0,4 Hz produjeron un rendimiento de memoria similar al generado con la presentación de color continuo (datos extendidos Fig. 4d, e). para grabaciones de γm KC porque produce respuestas más lentas y más grandes que ASAP2f, lo que consideramos beneficioso para la adquisición de imágenes que se intercalan con la presentación en color.Las moscas se expusieron secuencialmente cuatro veces al color CS+ y luego cuatro veces al color CS− con cada presentación de color seguida de un ciclo de adquisición de imágenes. Un intervalo de 30 s separó las grabaciones CS+ y CS−. El azul y el verde se usaron recíprocamente como CS+ y CS−. Se seleccionó aleatoriamente un hemisferio del cerebro para obtener imágenes de los axones KC. Rara vez es posible obtener imágenes de todos los compartimentos MB del lóbulo γ porque γ1 y γ5 suelen estar en diferentes planos. Por lo tanto, tuvimos que analizar estos dos compartimentos de forma independiente.

La fluorescencia se excitó usando pulsos de aproximadamente 140 fs, tasa de repetición de 80 MHz, centrada en 910 nm generada por un láser Ti-Sapphire (Chameleon Ultra II, Coherent). Se adquirieron imágenes de 256 × 256 píxeles a 5,92 Hz, controladas por el software ScanImage 3.872. Los olores se administraron mediante un sistema diseñado a medida73, controlado por LabView (v.11).

Para la aplicación aguda de 5-HT, utilizamos un sistema de bomba de perfusión (14-284-201, Fisher Scientific) para administrar continuamente solución salina a una velocidad de aproximadamente 0,043 ml s−1. Se aplicó 5-HT en presencia de tetrodotoxina 1 µM para bloquear los canales de sodio activados por voltaje y la propagación de potenciales de acción que podrían provocar una excitación indirecta. Para examinar los efectos de la serotonina en el voltaje de la membrana γd KC, se registró la fluorescencia de referencia durante 5 minutos antes de cambiar a una solución que contenía clorhidrato de serotonina 100 μM (H9523, Sigma Aldrich) durante 5 minutos adicionales de registro. El lavado se realizó cambiando la solución de nuevo a solución salina. El tiempo de aplicación y la concentración de 5-HT utilizada es comparable a estudios fisiológicos recientes que aplican 5-HT exógena al cerebro de Drosophila74,75,76,77. Debido a la longitud del tubo de perfusión y al volumen muerto, el interruptor de perfusión tardó aproximadamente 70 s en llegar al cerebro.

Para el análisis, las imágenes de fluorescencia de dos fotones se segmentaron manualmente utilizando Fiji78, utilizando un código personalizado que incluía un complemento estabilizador de imagen79. El movimiento de los animales fue lo suficientemente pequeño para que las imágenes no requirieran registro. Para los análisis cuantitativos posteriores, se utilizaron scripts personalizados de Fiji y MATLAB. La fluorescencia de referencia, F0, se definió para cada respuesta de estímulo como la fluorescencia media F desde 2 s antes y hasta el punto de presentación del olor o el color (o 30 s después del inicio de las grabaciones para los tratamientos con 5-HT). −ΔF/F0 describe en consecuencia la fluorescencia relativa a esta línea de base. Para las respuestas provocadas por el olor de los KC, el área bajo la curva se midió como la integral de −ΔF/F0 durante la estimulación del olor de 5 s. Elegimos mantener las unidades naturales del experimento cuando reportamos el área integrada bajo la curva (es decir, (−ΔF/F0) × (5 s)), porque no hacemos ninguna inferencia con respecto a la forma de la respuesta. Para las respuestas de KC provocadas por el color, se cuantificó la señal de fluorescencia media (−ΔF/F0) para el primer ciclo de adquisición (1,75 s). Cada n corresponde a una grabación de una mosca individual diferente. Todos los datos se adquirieron durante tres sesiones de entrenamiento diferentes en días diferentes.

Para los tratamientos con 5-HT, definimos el "pretratamiento" como el valor medio de −ΔF/F0 durante 300 s antes de la administración de 5-HT, la aplicación de 5-HT fue la media de −ΔF/F0 durante 300 s durante 5- La administración de HT y el tratamiento de 'lavado' como la media −ΔF/F0 durante 300 s desde la compensación de la administración del fármaco. Las trazas se suavizaron durante 5 s mediante un filtro de promedio móvil. Cada n corresponde a una grabación de una mosca individual diferente. Todos los datos se adquirieron a través de tres sesiones de imágenes diferentes en días diferentes.

Los datos de ASAP2f y ASAP2s se presentan como −ΔF/F0 para corregir la relación inversa entre la fluorescencia del sensor y el voltaje de la membrana.

Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism. Todos los datos de comportamiento se analizaron con una prueba t de dos caras no pareada, prueba U de Mann-Whitney, ANOVA unidireccional o prueba H de Kruskal-Wallis seguida de una prueba de comparaciones múltiples post-hoc de Tukey, Dunnett o Dunn. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los tamaños de muestra fueron similares a otras publicaciones en el campo. Para los experimentos de imágenes, las respuestas provocadas por olores se compararon mediante una prueba t de dos caras pareadas para datos distribuidos normalmente y ANOVA unidireccional de medidas repetidas, y se utilizó la prueba de rango con signo de Wilcoxon para datos distribuidos no gaussianos. La normalidad se probó mediante la prueba de normalidad de D'Agostino y Pearson. Para los datos de imágenes, se ejecutó un método para la identificación de valores atípicos para cada conjunto de datos (método ROUT), que se basa en la tasa de descubrimiento falso. La tasa de descubrimiento falso se fijó en el valor Q más alto posible (10 %). En conjuntos de datos en los que se identificaron posibles valores atípicos, se realizaron análisis estadísticos mediante la eliminación de todas las respuestas evocadas por olores para esas moscas. Los análisis con o sin los valores atípicos no fueron diferentes, por lo que decidimos mantener y presentar los conjuntos de datos completos, que pueden contener posibles valores atípicos. Se utilizó eta cuadrada parcial para informar los tamaños del efecto (η2 = 0,01 indica un efecto pequeño; η2 = 0,06 indica un efecto medio; η2 = 0,14 indica un efecto grande); la fórmula utilizada se informa en la tabla de estadísticas. Todos los análisis estadísticos también se informan en la tabla de estadísticas en la Información complementaria.

Los experimentos se aleatorizaron con controles apropiados presentes en cada experimento independiente. Todos los genotipos probados y analizados fueron auto cegados al experimentador. Más detalles sobre el diseño de la investigación se encuentran en el Resumen del Informe.

Se realizaron cálculos neuromorfológicos y análisis de conectividad, y se calcularon y trazaron dendrogramas, con scripts basados ​​en las funciones de la biblioteca NAVis 1.2.1 en Python 3.8.8 (https://pypi.org/project/navis/; https://github. com/navis-org/navis)80 y datos del hemibrain de Drosophila (v.1.2.1) (https://neuprint.janelia.org)32,33. Todos los esqueletos neuronales fueron curados (navis.heal_skeleton (method = "ALL", max_dist = "100 nanometer", min_size = 10)), rerooteados (navis.reroot_skeleton (x.soma)) y fuertemente muestreados con conectores conservados (navis. downsample_neuron(downsampling_factor = 1000, preserve_nodes = 'conectores')).

Las representaciones 3D de las neuronas sombreadas por orden de Strahler se generaron con navis.plot2d (method='3d', shade_by='strahler_index'), después de podar ramitas con orden de Strahler de 1 o menos (navis.prune_by_strahler()). En su caso, solo se consideraron sucursales en volúmenes específicos (navis.in_volume()). Los volúmenes se obtuvieron de neuprint (v.1.2.1) con fetch_roi(). La conectividad se analizó utilizando neuronas no podadas y con especificidad de compartimento (navis.in_volume()).

Se usaron scripts personalizados basados ​​en navis.plot_flat() para generar dendrogramas de neuronas DPM y APL con ramitas del orden de Strahler de 1 o menos podadas. Los límites de los compartimentos de MB se definieron mediante la conectividad con los DAN de los respectivos compartimentos. Las ramas fuera del lóbulo γ se redujeron manualmente para aumentar la visibilidad de los compartimentos del lóbulo γ. Las sinapsis se filtran mediante in_volume() y se muestran en ramas con un orden de Strahler de más de 1. Las estadísticas de conectividad se basan en neuronas no podadas, y las sinapsis entre neuronas se obtuvieron con natverse basado en R:: neuprint_get_synapses() (https://natverse.org )80 scripts y procesado con scripts personalizados en Python.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en https://github.com/PJZO/Multisensory-learning-Engram.git. El conjunto de datos para el hemicerebro de Drosophila mencionado en la sección 'Neuroanatomía, conectividad y dendrogramas' en los Métodos está disponible públicamente en https://neuprint.janelia.org.

Los scripts personalizados de MATLAB y Fiji/ImageJ están disponibles en https://github.com/PJZO/Multisensory-learning-Engram.git. El código mencionado en la sección 'Neuroanatomía, conectividad y dendrogramas' en los Métodos está disponible públicamente en https://pypi.org/project/navis/, https://github.com/navis-org/navis y https:/ /natverse.org.

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Descargar referencias

Agradecemos a R. Brain, K. delos Santos, R. Busby, M. Moreno Gasulla, J.-P. Moszynski y F. Woods por la asistencia técnica; y G. Rubin, FlyLight, B. Dickson, A. Lin y el Vienna Drosophila Resource Center, y el Bloomington Stock Center para moscas. ZO fue financiado por una beca postdoctoral a largo plazo de EMBO (ALTF 311-2017). PV-G. fue financiado por la Beca Sloane Robinson/Clarendon otorgada por el esquema Clarendon Fund de la Universidad y Keble College y por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). SW fue financiado por una beca de investigación principal de Wellcome (200846), un premio de descubrimiento de Wellcome (225192), una subvención avanzada de ERC (789274) y premios de colaboración de Wellcome (203261 y 209235).

nils otto

Dirección actual: Instituto de Anatomía y Neurobiología Molecular, Universidad de Münster, Münster, Alemania

Estos autores contribuyeron igualmente: Zeynep Okray, Pedro F. Jacob

Centro de Circuitos Neurales y Comportamiento, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

Zeynep Okray, Peter F. Jacob, Ciara Stern, Kieran Desmond, Nils Otto, Clifford B. Talbot, Paola Vargas-Gutiérrez y Scott Waddell

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ZO, PFJ, CBT y SW diseñaron la investigación. ZO, PFJ, CS, KD, NO y PV-G. realizó los experimentos. ZO, PFJ, CS, KD y NO analizaron los datos. SW proporcionó recursos. SW, ZO, PFJ y NO escribieron el manuscrito. SW supervisó el estudio. SW y ZO adquirieron financiación.

Correspondencia a Zeynep Okray o Scott Waddell.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a. Arriba a la izquierda, protocolos multisensoriales. Los cuadrados verdes y azules representan colores, los cuadrados grises claros y oscuros representan olores de OCT y MCH. Aprendizaje visual (V): colores utilizados como CS+ y CS−. Aprendizaje olfativo (O): olores utilizados como CS+ y CS−. Protocolo congruente (C): los colores+olores se combinaron como CS+ y CS−. Mismas combinaciones de color+olor utilizadas durante el entrenamiento y las pruebas. Protocolo incongruente (I): colores+olores se combinaron como CS+ y CS− pero las combinaciones se cambiaron entre entrenamiento y prueba. Abajo a la izquierda, cronograma de entrenamiento y prueba. Derecha, rendimiento de memoria de 24 h para protocolos V, O, C e I. La combinación de colores+olores en el protocolo congruente (C) mejoró el rendimiento de 24 h, en comparación con el obtenido con el aprendizaje unisensorial V u O. El emparejamiento incongruente (I) de colores y olores abolió la mejora multisensorial de la memoria de 24 h. b. Izquierda, cronograma de entrenamiento y pruebas. Medios, protocolos multisensoriales. Correcto, rendimiento de memoria inmediato. Las moscas mostraron una memoria significativamente mayor siguiendo el protocolo C que el I. C. Izquierda, cronograma de entrenamiento y pruebas. Protocolos multisensoriales intermedios: protocolo C como se describe anteriormente; Protocolo congruente que usa el mismo color (C−sc) combinado con diferentes olores como CS+ y CS− durante el entrenamiento y la prueba. A la derecha, el protocolo C que utiliza combinaciones distintas de color y olor para CS+ frente a CS− dio ​​como resultado un mayor rendimiento de la memoria inmediata que el protocolo C-sc que utiliza el mismo color con ambos olores. d. Izquierda, cronograma de entrenamiento y pruebas. Protocolos multisensoriales intermedios: aprendizaje olfativo (O) como se describe anteriormente; Recuperación multisensorial (MSR): los olores eran CS+ y CS− durante el entrenamiento y estos mismos olores se combinaron con diferentes colores durante la prueba. Correcto, el rendimiento de la memoria inmediata evocado por MSR no se redujo significativamente al siguiente para el aprendizaje y la recuperación olfativos. mi. Izquierda, cronograma de entrenamiento y pruebas. Protocolos multisensoriales intermedios: protocolo congruente (C) como se describe anteriormente; Recuperación de olores (OR): los colores y los olores fueron CS+ y CS− durante el entrenamiento y solo se utilizaron olores durante las pruebas. Correcto, las moscas entrenadas con estímulos multisensoriales se desempeñaron mejor si se probaron con estímulos multisensoriales congruentes en comparación con una sola modalidad (en este caso, el olor). Los asteriscos indican diferencias significativas (P < 0,05). Datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM). Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. Los grupos se compararon mediante ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey (a), la prueba t de dos colas no pareada (b, c, e) y la prueba U de Mann-Whitney de dos caras no pareada (d), se proporcionan los valores P exactos y las comparaciones en Información Complementaria. Los valores de N para cada experimento son: a, b, e, n = 10; c, n = 8; d, n = 10 para OR y n = 8 para MSR.

a. Arriba a la izquierda, esquema de γd KC. Abajo a la izquierda, línea de tiempo de entrenamiento y prueba con temperatura restrictiva constante (línea discontinua). A la derecha, el rendimiento de la memoria de 6 h después del aprendizaje olfativo no cambia cuando los KC γd se bloquean a través del experimento usando MB607B-GAL4; UAS-Mierda1 b y c. El bloqueo de los KC γd a lo largo del experimento perjudicó significativamente la memoria en el protocolo congruente (b). La liberación del efecto de interferencia del protocolo Incongruente no alcanzó significación (c). d. Arriba a la izquierda, esquema de αβp KC. Abajo a la izquierda, línea de tiempo de entrenamiento y prueba con temperatura restrictiva constante (línea discontinua). Derecha, bloqueo de la salida de KC de αβp durante todo el experimento usando c708a-GAL4; UAS-Shits1 no perjudicó el aprendizaje olfativo de 6 h. e y f. El rendimiento de la memoria para los protocolos Congruente (e) e Incongruente (f) cambió significativamente cuando se bloquearon los KC αβp durante el experimento. g y h. Arriba, cronograma de entrenamiento y prueba con cambio de temperatura (línea discontinua). Bloqueo de la memoria deteriorada de los KC γd (g) y αβp (h) recuperada con señales visuales. i. Arriba a la izquierda, esquema de γd KC. Arriba a la derecha, línea de tiempo de entrenamiento y prueba con temperatura permisiva constante (línea discontinua). il Rendimiento de la memoria en MB607B-GAL4; Las moscas UAS-Shits1 que siguen los protocolos Congruente (i), Incongruente (j), Recuperación olfativa (k) y Recuperación visual (l) no se vieron afectadas cuando el entrenamiento y la prueba se realizaron a 23 °C. metro. Arriba a la izquierda, esquema de αβp KC. Abajo a la izquierda, línea de tiempo de entrenamiento y prueba con temperatura permisiva constante (línea discontinua). mo Rendimiento de la memoria en c708a-GAL4; Las moscas UAS-Shits1 después de los protocolos Congruente (m), Incongruente (n) y Visual Retrieval (o) no se vieron afectadas cuando el entrenamiento y la prueba se realizaron a 23 °C. Los asteriscos indican diferencias significativas (P < 0,05). Datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM). Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. Los grupos se compararon mediante ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey (ag, io) y la prueba H de Kruskal-Wallis con la prueba de Dunn (h), los valores de P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. Los valores de N para cada experimento son: a—c, g, h, n = 12; d, n = 12 para c708a y n = 10 para todos los demás grupos, f, n = 10; io, n = 8.

a y B. Arriba a la izquierda, entrenamiento del apetito no emparejado y protocolo de formación de imágenes de olores. La presentación de color+olor no dependía del azúcar. Abajo a la izquierda, plano de imagen en la región γ5 (a) y γ1 (b) de γd KC. Medio, trazas de CS+ y CS− actividad evocada por olor. En ambas regiones de γd KC, el entrenamiento apetitivo multisensorial no emparejado no altera las respuestas de olor. Derecha, cuantificación de respuestas evocadas por olores. C. Respuestas evocadas por color (azul, verde y control, es decir, LED apagado) en la región γ5 de γd KC en moscas ingenuas. La adquisición de imágenes se cierra durante la presentación en color. A la derecha, la cuantificación muestra respuestas excitatorias a luces azules, verdes y control (LED apagado). D y E. La entrega pulsada de luz de color no afecta el rendimiento de la memoria multisensorial en el protocolo congruente (d) o la recuperación visual (e) después del aprendizaje multisensorial. Los asteriscos indican diferencias significativas (P < 0,05). Datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM). Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. f y g Arriba a la izquierda, entrenamiento apetitivo multisensorial (color+olor, f) y unisensorial (olor, g) y cronogramas de imágenes de olores. Abajo a la izquierda, plano de imagen en γd KC somata. Medio, trazas de CS+ y CS− actividad evocada por olor. Las respuestas inhibitorias a los olores CS+ y CS− (disminución de −ΔF/F0) fueron evidentes siguiendo cualquiera de los dos paradigmas. Correcto, cuantificación. h y yo Arriba a la izquierda, cronogramas de imágenes de olores y entrenamiento multisensorial apetitivo (color+olor). Abajo a la izquierda, plano de imagen en las regiones γ5 (h) y γ1 (i) de los KC γm. Medio, trazas de CS+ y CS− actividad evocada por olor. Las regiones γ1 y γ5 de los KC γm muestran excitación a los olores CS+ y CS− (aumentos en −ΔF/F0). Correcto, cuantificación. Para todos los rastros y la cuantificación, la presentación de CS+ y CS− implicó una alternancia de 50:50 de los olores como en todos los demás experimentos. Los rastros de actividad provocados por olores o colores muestran la media (línea continua) con SEM (sombra). Las líneas discontinuas horizontales indican la actividad de referencia. La línea negra debajo de los rastros marca 5 s de exposición al olor. En (c) la barra vertical gris corresponde a los 0,75 s de presentación de color (cuando la adquisición de imágenes está cerrada) y el cuadro al período (1,75 s) de cuantificación. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre las respuestas CS+ y CS− promediadas (P < 0,05). Respuestas CS+ y CS− para cada mosca individual conectadas por una línea discontinua. Los grupos se compararon mediante la prueba t de dos caras pareadas (a,b, fi), la prueba t de una muestra (c), ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey (d) y la prueba t de dos caras no pareada (e) , los valores P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. Los valores de N para cada experimento son: a, b, n = 20 moscas; c, n = 20 moscas para Verde, n = 20 moscas para Azul, n = 6 para LED apagado; d, e, n = 8; f, g, n = 22 moscas; h, i, n = 16 moscas.

a. Línea de tiempo superior, aversiva de entrenamiento y prueba. Fondo, condiciones experimentales multisensoriales. Los cuadrados verdes y azules representan colores, los grises claros y oscuros representan olores de OCT y MCH. aprendizaje visual (V); Aprendizaje olfativo (O); Protocolo congruente (C); protocolo incongruente (I); Recuperación Olfatoria (OR); Recuperación Visual (VR). bd. Arriba, cronogramas de entrenamiento y pruebas. Abajo, la memoria aversiva con el protocolo C aumentó significativamente a la del protocolo I tanto inmediatamente (b) como 3 h (c) después del entrenamiento. Las moscas en el protocolo C superaron a las probadas 3 h después del aprendizaje olfativo (O). Solo el protocolo C generó un rendimiento de memoria significativo de 24 h (d). e y f. Arriba, cronogramas de entrenamiento y pruebas. En la parte inferior, cuando se probó inmediatamente (e), la memoria multisensorial recuperada con colores (VR) fue notablemente mejor que la que siguió al aprendizaje visual unisensorial (V). A las 3 h (f), las moscas entrenadas multisensoriales se desempeñaron significativamente mejor cuando su memoria se recuperó solo con señales olfativas (OR) o visuales (VR) que las moscas entrenadas con aprendizaje unisensorial olfativo (O) o visual (V). gramo. Arriba a la izquierda, esquema de γd KC. Abajo a la izquierda, cronograma de entrenamiento y prueba con cambio de temperatura (línea discontinua). soldado americano. Bloqueo de la salida de los KC γd durante las pruebas con MB607B-GAL4; UAS-Shits1 altera el rendimiento de la memoria de 3 h en los protocolos Congruent (g), Incongruent (h) y Olfatory Retrieval (i). j. Arriba a la izquierda, esquema de γd KC. Abajo a la izquierda, línea de tiempo de entrenamiento y prueba con temperatura permisiva constante (línea discontinua). rendimiento de memoria jl en MB607B-GAL4; Las moscas UAS-Shits1 después de los protocolos congruente (j), incongruente (k) y de recuperación olfativa (l) no se vieron afectadas cuando las moscas se entrenaron y probaron a 23 °C. Los asteriscos indican diferencias significativas (P < 0,05). Datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM). Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. m y n Arriba a la izquierda, entrenamiento aversivo unisensorial y protocolo de formación de imágenes de olores. Abajo a la izquierda, plano de imagen en la región γ1 (m) y γ5 (n) de γd KC. Medio, trazas de CS+ y CS− actividad evocada por olor. El entrenamiento aversivo uniisensorial no altera las respuestas de olor en ninguna de las regiones γd KC. Correcto, cuantificación. o y p. Arriba a la izquierda, entrenamiento multisensorial aversivo no emparejado y protocolo de formación de imágenes de olores. La presentación de color+olor no dependía del shock. Abajo a la izquierda, plano de imagen en la región γ1 (o) y γ5 (p) de γd KC. Medio, trazas de CS+ y CS− actividad evocada por olor. El entrenamiento aversivo multisensorial no emparejado no altera las respuestas de olor en ninguna de las regiones γd KC. Correcto, cuantificación. Para todos los rastros y la cuantificación, la presentación de CS+ y CS− implicó una alternancia de 50:50 de los olores como en todos los demás experimentos. Los rastros de actividad provocados por olores muestran la media (línea continua) con SEM (sombra). Las líneas discontinuas horizontales indican la actividad de referencia. La línea negra debajo de los rastros marca 5 s de exposición al olor. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre las respuestas CS+ y CS− promediadas (P < 0,05). Respuestas CS+ y CS− para cada mosca individual conectadas por una línea discontinua. Los grupos se compararon mediante ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey (bd, gl), la prueba t de dos caras no pareada (e, f) y la prueba t de dos caras pareada (mp), los valores de P exactos y las comparaciones se dan en Complementario Información. Los valores de N para cada experimento son: b, g, il, n = 8; c, e, f, h, n = 10; d, n = 12; m, n, n = 22 moscas; o, p, n = 24 moscas.

a. Una proyección de dendrograma bidimensional de neuritas de neuronas DPM (tonos de verde azulado). La rama dorsal de los compartimentos γ2-γ5 del lóbulo horizontal es verde azulado oscuro, el resto de las proyecciones del lóbulo γ son verde azulado medio y las de los otros lóbulos son verde azulado más claro. Nota: todas las neuritas del lóbulo γ, excepto las del lóbulo γ, están reducidas para ser visibles. Las neuritas con orden de Strahler <1 se eliminan y la conectividad se muestra en consecuencia. Las proyecciones en el compartimento γ1 están marcadas y divididas en los compartimentos γ2-5 en ramas dorsal y ventral. El marcado corresponde a la conectividad DAN (áreas sombreadas). Las sinapsis (esferas) solo están marcadas en los compartimentos del lóbulo γ. La estructura de conectividad muestra las entradas de los KC γd (esferas amarillas) y las salidas de los KC γm (esferas grises) colocadas en ramas específicas del compartimento de las neuronas DPM. Las entradas de APL (magenta) se distribuyen en las ramas dorsal y ventral y se concentran alrededor del punto de ramificación en la base de los lóbulos verticales en el compartimento α′1 (asterisco). Nota: Algunas partes putativas de la rama del lóbulo γ dorsal no se pudieron asignar a un compartimento debido a la falta de entrada de DAN. Una rama que lleva sinapsis γ KC (hashtag) se identificó como la rama del lóbulo β′ que ingresa al MB cerca de la línea media. Es probable que otras puntas de neuritas DPM que tienen sinapsis γ KC sean artefactos en los que la curación ha fusionado ramificaciones de lóbulos γ que flotan libremente con neuritas DPM que inervan los otros lóbulos. b. Una proyección de dendrograma bidimensional de neuritas de neuronas APL (magenta). Nota: las neuritas con orden de Strahler <1 se eliminaron y la conectividad se muestra en consecuencia. Comparar con (a). Las sinapsis de entrada PPL1-γ1pedc y PAM-γ5 DAN (esferas rojas y verdes respectivamente) están marcadas en los compartimentos γ1 y γ5 (áreas sombreadas). Las sinapsis con las neuronas DPM (esferas verde azulado) colocalizan con la entrada DAN.

a y B. Arriba, Anatomía de la neurona APL. Líneas de tiempo de entrenamiento y prueba con temperatura restrictiva constante (línea discontinua). Abajo, caída de Dop2R restringida para adultos con ARNi en neuronas APL usando tubPGAL80ts; VT43924-GAL4.2 deterioró el rendimiento de la memoria de recuperación olfativa de 6 h después del entrenamiento apetitivo multisensorial (a) y redujo la memoria después del aprendizaje olfativo unisensorial (b). c y d. Experimentos de control de temperatura permisiva (23 ° C) para (a) y (b). Arriba, cronogramas de entrenamiento y prueba con cambio de temperatura (línea discontinua). El rendimiento de la memoria no se vio afectado en las moscas tubPGAL80ts;VT43924-GAL4.2, UAS-Dop2R RNAi después de la recuperación olfativa (c) y el aprendizaje olfativo (d) cuando las moscas se criaron, entrenaron y probaron a 23 °C. e y f. Arriba, cronogramas de entrenamiento y prueba con temperatura (línea discontinua). Abajo, 6 h La recuperación olfativa de la memoria multisensorial apetitiva (e) y de la memoria después del aprendizaje olfativo (f) no se vio afectada por la eliminación de DopEcR por ARNi restringida por adultos en neuronas APL usando tubPGAL80ts; VT43924-GAL4.2. Los asteriscos indican diferencias significativas (P < 0,05). Datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM). Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. Todos los grupos se compararon utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey, los valores de P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. Los valores de N para cada experimento son: a, b, n = 12; c, d, n = 8; mi, f, n = 10.

a. Experimento de control de temperatura permisiva (23 ° C) para la Fig. 5c, d. Arriba, cronograma de entrenamiento y pruebas. Abajo, rendimiento de la memoria multisensorial evocado por la recuperación olfativa de VT64246-GAL4; Las moscas UAS-Shits1 no se vieron afectadas cuando las moscas se entrenaron y probaron a 23 °C. b. Arriba, cronograma de entrenamiento y prueba con cambio de temperatura (línea discontinua). Abajo, el bloqueo de la salida de las neuronas DPM durante la prueba perjudicó la recuperación visual de la memoria multisensorial. C. Experimento de control de temperatura permisiva (23 °C) para datos extendidos Fig. 7b. Arriba, cronograma de entrenamiento y pruebas. Abajo, rendimiento de memoria multisensorial evocado por Visual Retrieval de VT64246-GAL4; Las moscas UAS-Shits1 no se vieron afectadas cuando las moscas se entrenaron y probaron a 23 °C. d. Arriba, cronograma de entrenamiento y prueba con cambio de temperatura (línea discontinua). En la parte inferior, el bloqueo de la salida de las neuronas DPM durante el entrenamiento y las pruebas unisensoriales no afectó el rendimiento del aprendizaje olfativo. mi. Arriba a la izquierda, esquema de γ KC. p.ej. Arriba, cronograma de entrenamiento y prueba con cambio de temperatura (línea discontinua). Abajo, bloqueo de salida de γ KC durante el entrenamiento con MB009B-GAL4; UAS-Shits1 no afectó el rendimiento de aprendizaje olfativo de 6 h (e), mientras que el rendimiento de la memoria de recuperación olfativa (f) y recuperación visual (g) se vio significativamente afectado. h y yo Experimentos de control de temperatura permisiva (23 °C) para datos extendidos Fig. 7f, g. Arriba, cronogramas de entrenamiento y pruebas. Abajo, rendimiento de la memoria multisensorial evocado por la recuperación olfativa (h) o la recuperación visual (i) de MB009B-GAL4; Las moscas UAS-Shits1 no se vieron afectadas cuando las moscas se entrenaron y probaron a 23 °C. j y k. A la izquierda, entrenamiento unisensorial (olor) apetitivo y línea de tiempo de imágenes de olores. Planos de imagen en las regiones γ5 (j) y γ1 (k) de la neurona DPM. Correcto, cuantificación. 6 h después del entrenamiento olfativo, las regiones γ5 (j) y γ1 (k) de las neuronas DPM mostraron respuestas excitatorias indistinguibles a los olores CS+ y CS−. k y l Líneas de tiempo de entrenamiento e imágenes de olores multisensoriales (color + olor) o unisensoriales (olor). Plano de imagen en la región γ5 de las neuronas DPM. Abajo, la cuantificación de las respuestas γ5 de las neuronas DPM 1 h después del entrenamiento multisensorial (l) y unisensorial (m) mostró una respuesta excitatoria mejorada a los olores CS+ sobre los CS−. n y o Líneas de tiempo de entrenamiento e imágenes de olores multisensoriales (color + olor) o unisensoriales (olor). Plano de imagen en la región γ1 de la neurona DPM. En la parte inferior, la cuantificación de las respuestas γ1 de las neuronas DPM 1 h después del entrenamiento multisensorial (n) y unisensorial (o) no mostró diferencias entre las respuestas excitatorias a los olores CS+ y CS−. p y q. Arriba, plano de imagen en la región γ1 (p) y γ5 (q) de los KC γd. Paneles inferiores izquierdos, un registro de referencia en solución salina (300 s; no se muestra) fue seguido por perfusión de 5-HT 100 μM durante 300 s y luego lavado en solución salina durante 300 s. Se muestran las trazas promedio para la aplicación del baño y el lavado. A la derecha, la cuantificación muestra respuestas excitatorias a la aplicación de 5-HT en ambas regiones (aumento de la media –ΔF/F0), en comparación con la línea de base (pre) y después del lavado. R. Arriba a la izquierda, esquema de γd KC. Abajo a la izquierda, cronograma de entrenamiento y prueba. Derecha, el rendimiento del aprendizaje olfativo de 6 h no se ve afectado en moscas con caída de ARNi de 5-HT2A con MB607B-GAL4. Los asteriscos indican diferencias significativas (P < 0,05). Datos presentados como media ± error estándar de la media (SEM). Los puntos de datos individuales que se muestran como puntos corresponden a experimentos independientes. s. A la izquierda, entrenamiento multisensorial apetitivo (color+olor) y línea de tiempo de imágenes en color. Plano de imagen en la región γ5 de los axones γd KC. Medio, trazas de actividad evocada por colores CS+ y CS−. La región γ5 de los axones γd KC mostró respuestas excitatorias a los colores CS+ y CS−. Derecha, cuantificación de las respuestas evocadas por el color. Para trazas en (s) y todas las cuantificaciones, la presentación de CS+ y CS− implicó una alternancia de 50:50 de los olores y/o colores como en todos los demás experimentos. Los rastros de actividad evocados por color muestran la media (línea continua) con SEM (sombra). En (s), la barra gris vertical corresponde a la presentación de color de 0,75 s (cuando la adquisición de imágenes está cerrada) y el cuadro al período de cuantificación de 1,75 s. Las líneas discontinuas horizontales indican la actividad de referencia. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre las respuestas CS+ y CS− promediadas (P < 0,05). Respuestas CS+ y CS− para cada mosca individual conectadas por una línea discontinua. Los grupos se compararon mediante ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey (ae, gi, r), la prueba H de Kruskal-Wallis con la prueba de Dunn (f), la prueba t de dos caras pareadas (jo, s) y medidas repetidas unidireccionales ANOVA con la prueba de Tukey (p, q), los valores P exactos y las comparaciones se proporcionan en Información complementaria. Los valores de N para cada experimento son: ac, r, n = 8; d, n = 12; ei, n = 8; j, k, n, n = 18 moscas; l, m, o, s, n = 16 moscas; o, p, n = 10.

valores de n, estadísticas descriptivas y análisis estadísticos con valores P exactos para las Figs. 1–5.

valores de n, estadísticas descriptivas y análisis estadísticos con valores P exactos para datos extendidos Figs. 1–7.

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Reimpresiones y permisos

Okray, Z., Jacob, PF, Stern, C. et al. El aprendizaje multisensorial une las neuronas en un engrama de memoria intermodal. Naturaleza 617, 777–784 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06013-8

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Recibido: 07 julio 2022

Aceptado: 24 de marzo de 2023

Publicado: 26 abril 2023

Fecha de emisión: 25 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06013-8

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