Desarrollo de microglía

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1224 (2022) Citar este artículo

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Aquí describimos los vectores virales adenoasociados (AAV) dirigidos a la microglía que contienen una región promotora putativa de 1,7 kb de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado específica de microglía/macrófagos 1 (Iba1), junto con sitios diana de miARN repetidos para microARN (miR )-9 y miR-129-2-3p. La secuencia genómica de 1,7 kb corriente arriba del codón de inicio en el exón 1 del gen Iba1 (Aif1), funciona como promotor preferencial de microglía en el cuerpo estriado y el cerebelo. Además, la expresión del transgén ectópico en células no microgliales se suprime notablemente al agregar dos conjuntos de sitios diana de miARN de 4 repetidos para miR-9 y miR-129-2-3p, que se expresan exclusivamente en células no microgliales y esponjas AAV- ARNm derivados. Nuestros vectores transdujeron microglía ramificada en tejidos sanos y microglía reactiva en ratones tratados con lipopolisacáridos y un modelo de ratón de enfermedad neurodegenerativa. Además, las imágenes fluorescentes en vivo permitieron monitorear la motilidad microglial y la movilización de Ca2+ intracelular. Por lo tanto, los vectores AAV dirigidos a la microglia son valiosos para estudiar la fisiopatología y las terapias microgliales, particularmente en el cuerpo estriado y el cerebelo.

Se sabe que la microglía, que son células inmunitarias que residen en el sistema nervioso central (SNC), proporciona funciones de vigilancia y eliminación. Sin embargo, estudios más recientes han revelado diversas funciones de la microglía en el SNC, incluido el desarrollo cerebral1,2, la remodelación de circuitos neuronales1,3 y la progresión de enfermedades neurodegenerativas4,5,6.

Avances tecnológicos recientes han permitido la expresión viral de diversas moléculas funcionales etiquetadas con proteínas fluorescentes, como G-CaMP (sensor de calcio)7 y ArcLightning (sensor de voltaje de membrana)8 para registro óptico y diversos canales iónicos sensibles a la luz para optogenética9. En estas circunstancias, los vectores virales que transducen específicamente las células microgliales en el cerebro in vivo son herramientas poderosas para explorar la función y el comportamiento de la microglia en el entorno cerebral nativo. Además, la microglía es quimioatraída hacia los sitios de lesión en el cerebro;10,11,12 por lo tanto, la microglía transducida puede aprovecharse para administrar un producto génico terapéutico al tejido lesionado.

Para entregar un transgén a la microglía in vivo, el grupo de Jakobsson usó vectores lentivirales con un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK) y cuatro secuencias complementarias repetidas de microARN-9-objetivo (miR-9.T)13. Dado que miR-9 se expresaba endógenamente en células no microgliales pero no en microglia, el ARN mensajero transgénico (ARNm) que contenía miR-9.T se absorbió exclusivamente en células no microgliales, lo que condujo a la expresión transgénica selectiva en microglia. A continuación, se demostró que más del 70 % de las células transducidas en el estriado de rata eran microglía13. Sin embargo, cambiar el promotor de PGK a un promotor fuerte de citomegalovirus (CMV) en el casete transgénico de vectores lentivirales provoca una fuga importante de expresión transgénica en neuronas y astrocitos14. Además, estudios relevantes han demostrado la inducción de miR-9 en la microglía tras su activación15,16,17, lo que sugiere la posible supresión de la expresión transgénica en la microglía reactiva.

Estudios previos desafiaron la transducción de microglía utilizando vectores de cápside de serotipo 2, 5 y mutante 6 del virus adenoasociado (AAV) que comprenden promotores específicos de microglía, como los de F4/80 y CD6818,19. Sin embargo, dieron como resultado solo un éxito menor con algunos "dirigidos a una sola microglía", probablemente debido a la débil actividad del promotor y la baja capacidad de unión de las cápsidas de AAV a la microglía. Por lo tanto, para la transducción eficiente y selectiva de microglia, se requiere un promotor robusto específico de microglia y una cápside AAV microglia-trópica. Entre los tipos de cápside de AAV aislados de forma natural, AAV1 y AAV9 en la corteza cerebral y AAV1 en el cuerpo estriado causaron una alta expresión transgénica en la microglía. Sin embargo, además de la microglía, AAV1 en el cuerpo estriado también mostró preferencia por los astrocitos y las neuronas20.

En este estudio, desarrollamos vectores AAV2/9 dirigidos a la microglía (cápside de AAV9 y genoma viral de AAV2) que llevan una región promotora putativa de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado específica de microglía/macrófagos 1 (Iba1), miR-9.T, y secuencias diana adicionales unidas de manera complementaria por miR-129-2-3p, un miARN diferente que se expresó selectivamente en poblaciones de células no microgliales en el SNC21,22,23.

Para probar la orientación microglial, producimos cinco construcciones de AAV que llevan el promotor PGK o el supuesto promotor Iba1 con o sin secuencias diana de miARN cuádruple para miR-9, miR-129-2-3p o miR-136-5p, como se muestra (Fig. 1a -mi). Los perfiles de microglía dirigidos a estas construcciones de AAV se evaluaron en tres regiones cerebrales diferentes: la corteza cerebral (corteza frontal), el cuerpo estriado y el cerebelo. Se seleccionó el cuerpo estriado para comparar nuestros resultados con un informe anterior que utilizó vectores lentivirales con miR-9.T13, mientras que junto con el cuerpo estriado, se eligió la corteza frontal y el cerebelo porque la función microglial aberrante en estas regiones del cerebro se ha asociado con varios trastornos neurodegenerativos. , como la enfermedad de Alzheimer y las ataxias cerebelosas24,25,26. En general, el patrón de expresión transgénica de AAV depende de la dosis de inyección y del período de incubación posterior. Para detectar las propiedades dirigidas a la microglía, esperamos una semana después de la inyección de AAV en un título relativamente alto (3.9 × 1012 genoma viral (vg) /mL; Fig. 1f). El volumen de inyección (0,5 μL para la corteza cerebral, 1 μL para el cuerpo estriado y 10 μL para el cerebelo) se determinó mediante varios ensayos preliminares de inyección con referencia a informes anteriores13,27. Después de elegir la construcción de AAV más adecuada para la microglia, el período de incubación se extendió al reducir la dosis de inyección para optimizar la especificidad de la transducción microglial.

Los vectores a-e AAV comprenden el promotor PGK constitutivo (a) o el promotor Iba1 (b-e) seguido de GFP, WPRE y poliA. Además, se insertaron uno o dos conjuntos de cuatro secuencias objetivo repetidas de microARN (miR) (4 × miR-9.T y 4 × miR-129-2-3p.T o 4 × miR-136-5p.T) entre las secuencias WPRE y polyA (a, c-e). Cada construcción se marcó con el nombre abreviado del promotor (PGK o Iba1) más la(s) diana(s) miR incorporada(s) como se describe. f Los ratones recibieron diferentes dosis de cada vector AAV (3,9 × 1012 vg/mL) en la corteza cerebral (0,5 μL), cuerpo estriado (1 μL) y cerebelo (10 μL). Una semana después de la inyección viral, los cerebros de los ratones tratados fueron examinados por inmunohistoquímica. Proteína fluorescente verde mejorada con GFP, molécula adaptadora de unión al calcio ionizado Iba1 1, inmunohistoquímica IHC, repetición terminal invertida ITR, fosfoglicerato quinasa 1 de PGK, secuencia de señal de poliadenilación del virus de simio poliA 40, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota WPRE.

Un estudio previo mostró que la inyección de vectores lentivirales que expresan cuatro copias repetidas de miR-9.T por el promotor PGK en el estriado de rata adulta resultó en la transducción predominante de microglia13. Los vectores AAV2/9 que portaban el casete transgénico, que eran esencialmente idénticos a los vectores lentivirales (AAV9.PGK.miR-9.T; Fig. 1a), se inyectaron en la corteza cerebral, el cuerpo estriado y el cerebelo. Una semana después de la inyección, se cortaron los cerebros y se inmunomarcaron para GFP e Iba1. Descubrimos que la mayoría de las células que expresan GFP tenían morfologías distintas de la microglía ramificada y no estaban co-inmunomarcadas con Iba1 (Fig. 1 complementaria). El análisis cuantitativo mostró que las proporciones de células positivas para GFP e Iba1 a células positivas para GFP fueron ~ 10% o menos en la corteza cerebral y el cuerpo estriado y 34% en el cerebelo (Tabla 1 y Fig. 1c complementaria).

Previamente, nos dirigimos con éxito a poblaciones celulares específicas utilizando vectores AAV con promotores específicos del tipo de célula, como el promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (astrocitos)28, el promotor de la enolasa específica de neuronas (NSE) (neuronas)29, L7-6 promotor [células de Purkinje del cerebelo (PC)]30, y promotor de la descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) 65 (mGAD65) de ratón (neuronas inhibidoras)27. En particular, encontramos que la secuencia del genoma aguas arriba del primer ATG de un gen específico del tipo de célula a menudo sirve como promotor específico del tipo de célula27,30. Por lo tanto, decidimos aprovechar esta estrategia. Un estudio anterior utilizó una región genómica Iba1 (Aif1) de 1,9 kb que contenía el exón 1, el intrón 1 y una parte del exón 2 para producir ratones transgénicos específicos de microglía (Figura complementaria 2a)31. Por lo tanto, probamos si la región genómica correspondiente aguas arriba del primer ATG en el exón 1 del gen Iba1 (Fig. 2a, b complementaria) funcionaba de manera específica para la microglía cuando se incorporaba a los vectores AAV (en adelante, el Iba1 de ratón de 1678 pb). región genómica se denomina promotor Iba1). Los vectores AAV2/9 que expresan GFP a través del promotor Iba1 (AAV9.Iba1) se inyectaron en la corteza cerebral, el cuerpo estriado y el cerebelo a la misma dosis que AAV9.PGK.miR-9.T (Fig. 1b, f).

Una semana después de la inyección, se observó una transducción eficiente de microglia (células doblemente positivas GFP e Iba1) en el cuerpo estriado y el cerebelo (Fig. 3e-g y h-j complementarias), con algunas células no microgliales negativas para Iba1 transducidas ( flechas en la figura complementaria 3f, g, i, j). Por el contrario, la mayoría de las células que expresan GFP en la corteza cerebral eran células similares a neuronas piramidales negativas para Iba1 (Fig. 3b-d complementaria). El análisis cuantitativo mostró que ~69 % y ~86 % de las células positivas para GFP en el cuerpo estriado y el cerebelo, respectivamente, eran microglía positiva para Iba1, mientras que la microglía positiva para Iba1 retuvo solo el 2 % de las células que expresan GFP en la corteza cerebral (Tabla 1 y Fig. 3k complementaria). Estos resultados sugieren que el promotor Iba1 funciona preferentemente en la microglía residente en el cuerpo estriado y el cerebelo, pero no en la corteza cerebral.

Agregamos secuencias de miR-9.T a AAV9.Iba1 después del elemento de regulación postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) (AAV9.Iba1.miR-9.T; Fig. 1c y Fig. 4a complementaria). La secuencia diana de miR se repitió cuatro veces, ya que los informes anteriores demostraron que los niveles de supresión de la diana aumentaron a medida que aumentaba el número de sitios diana de miR32,33,34. La eficacia de cada sitio diana miR en la construcción con cuatro dianas miR fue dos veces mayor que la de cada sitio en la construcción con dos sitios diana miR, pero fue similar a la de la construcción con seis sitios diana miR35. Elegimos una repetición de cuatro veces en términos de eficacia para la supresión de objetivos y ahorro de espacio de alojamiento para un transgén.

AAV transdujo eficientemente la microglía ramificada en las tres regiones del cerebro (Fig. 4b-j complementaria). Sin embargo, en la corteza cerebral, se transdujeron numerosas células no microgliales Iba1 negativas, caracterizadas por grandes somas, alrededor del epicentro del sitio de inyección viral (Fig. 4b, d complementarias), mientras que se observó una transducción microglial selectiva en una región alejada desde el epicentro (Fig. 4b, c complementaria). El análisis cuantitativo reveló que casi todas las células positivas para GFP en el estriado y el cerebelo eran microglía positiva para Iba1, mientras que la proporción de microglía transducida con respecto al total de células transducidas fue solo ~ 27% en la corteza cerebral (Tabla 1 y Fig. 4k complementaria). Por lo tanto, la adición de la secuencia miR-9.T desactivó significativamente las células no microgliales en las tres regiones del cerebro, aunque la desorientación no microglial en la corteza cerebral siguió siendo insuficiente.

Para suprimir aún más la expresión transgénica en células no microgliales, incorporamos un objetivo cuádruple microRNA-129-2-3p adicional (miR-129-2-3p.T) o un objetivo microRNA-136-5p (miR-136-5p.T) ) secuencias después de quadruplex miR-9.T (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T o 136-5p.T) (Fig. 1d, e). Al igual que miR-9, se demostró que tanto miR-129-2-3p como miR-136-5p estaban enriquecidos en las neuronas y disminuidos en la microglía22, lo que sugiere que tanto miR-129-2-3p como miR-136-5p probablemente suprimen la expresión de un ARNm transgénico que contiene sitios diana de miARN en células no microgliales. Inyectamos estos AAV de manera similar en tres áreas cerebrales diferentes y analizamos inmunohistoquímicamente los perfiles de expresión del transgén 1 semana después de la inyección viral. El análisis de microscopía confocal de los cortes de cerebro tratados con AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T reveló una transducción microglial altamente específica en las tres regiones del cerebro (Fig. 2a-j). En particular, las neuronas en la corteza cerebral se eliminaron en gran medida (Fig. 2b-d). El análisis cuantitativo mostró que ~87 % de las células transducidas en la corteza cerebral y casi todas las células transducidas en el cuerpo estriado y el cerebelo eran microglia (Tabla 1). En contraste con miR-129-2-3p.T, la adición de miR-136-5p.T a AAV9.Iba1.miR-9.T no logró eliminar las células no microgliales en la corteza cerebral (Fig. 5 complementaria ).

un esquema de la construcción AAV que comprende el promotor Iba1, GFP y dos secuencias cuádruples diferentes complementarias a miR-9 y miR-129-2-3p. Los ratones recibieron diferentes dosis de AAV (3,9 × 1012 vg/mL) en la corteza cerebral (0,5 μL), cuerpo estriado (1 μL) y cerebelo (10 μL). Una semana después de la inyección viral, los cerebros de los ratones se examinaron mediante inmunohistoquímica. (bd) Inmunohistoquímica de la corteza cerebral. Se ampliaron las regiones cuadradas en b. Tenga en cuenta la expresión fuerte y eficiente de GFP en microglia con transducción débil y rara de células no microgliales negativas para Iba1 (flechas). e–j Transducción altamente específica de microglía en el cuerpo estriado (e–g) y el cerebelo (h–j). Se ampliaron las regiones cuadradas en (e, h). Barras de escala; 100 μm (b, e, h) y 20 μm (c, d, f, g, i, j). Capa de células granulares GL, capa molecular ML.

A continuación, examinamos la eficiencia de transducción de la microglía, que se evaluó dividiendo el porcentaje de células doblemente positivas para GFP e Iba1 (microglía transducida) por el recuento total de microglía inmunorreactiva para Iba1. Los vectores AAV en la dosis probada transdujeron aproximadamente del 50 al 90 % de la microglía en las tres regiones del cerebro (Fig. 6 complementaria). En presencia de miR-9.T, la eficiencia de transducción aumentó significativamente al cambiar del promotor PGK al promotor Iba1 en la corteza cerebral y el cuerpo estriado. La adición de miR-129-2-3p.T a AAV9.Iba1.miR-9.T no afectó la eficiencia de transducción en las tres regiones del cerebro examinadas.

La inyección parenquimatosa directa de AAV altera la microvasculatura cerebral, lo que puede provocar la entrada de monocitos derivados de sangre positivos para Iba1 en el tejido cerebral. Para verificar si las células marcadas con GFP contenían estos monocitos infiltrantes, se inyectó AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T en el estriado y el cerebelo como se muestra en la Fig. 2. Una semana después de la inyección, las secciones del cuerpo estriado y del cerebelo se inmunomarcaron triplemente para GFP, Iba1 y la proteína transmembrana 119 (TMEM119), un marcador microglial altamente específico que no se expresa en macrófagos del SNC, células dendríticas, monocitos infiltrantes u otros tipos de células inmunes o neurales36 (Fig. 7). Examinamos células doblemente positivas para GFP e Iba1 (n = 299 células en las cinco secciones del cuerpo estriado de tres ratones y n = 207 células en tres secciones del cerebelo de dos ratones), todas las cuales también resultaron positivas para TMEM119, lo que indica poca o ninguna contaminación de monocitos infiltrados en tejidos cerebrales inyectados con AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T.

Además, para confirmar que las células transducidas no eran astrocitos, las secciones del estriado y el cerebelo se inmunoteñeron para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), un marcador para los astrocitos (Fig. 8 complementaria). Buscamos cuidadosamente células doblemente positivas para GFP y GFAP (astrocitos) (cinco secciones del estriado de tres ratones y tres secciones del cerebelo de dos ratones), pero no pudimos encontrar dichas células.

Examinamos el perfil de transducción tres semanas después de la inyección de AAV (Fig. 3a). En el cuerpo estriado, la transducción dirigida a microglia se conservó con una expresión débil de GFP en células no microgliales (Fig. 3b). Más del 80 % de las células positivas para GFP eran microglías positivas para Iba1 (80,6 ± 1,5 %; 2061 células en 2576 células positivas para GFP, n = 9 ratones) (Fig. 3g). Sin embargo, en el cerebelo, la especificidad por la microglia disminuyó a aproximadamente un 60 % (56,1 ± 5,2 %; 896 microglia en 1637 células positivas para GFP, n = 7 ratones) (Fig. 3c, g). Dado que el cerebelo recibió una dosis de AAV 10 veces mayor que el cuerpo estriado, redujimos la dosis de inyección a una cuarta parte (de 3,9 × 1010 vg/ratón a 1,0 × 1010 vg/ratón), lo que resultó en un aumento significativo de la microglía especificidad al 83% (82,5 ± 4,9%, 890 células en 1067 células positivas para GFP, n = 7 ratones) (Fig. 3d, g).

una construcción AAV (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T) y esquema de la inyección de virus. Los ratones que recibieron una inyección de AAV en tres regiones del cerebro a la misma dosis que la Fig. 2 (dosis alta; H) o aproximadamente una cuarta parte (dosis baja; L) se examinaron 3 semanas después de la inyección mediante inmunohistoquímica. b–f Inmunohistoquímica del cuerpo estriado (b), cerebelo (c, d) y corteza cerebral (e, f). Las dosis inyectadas se describieron arriba de los esquemas. Tenga en cuenta la expresión fuerte y eficiente de GFP en microglia con transducción débil de células no microgliales negativas para Iba1 en el cuerpo estriado y el cerebelo (b, c). Por el contrario, la corteza cerebral mostró expresión de GFP principalmente en células no microgliales, incluidas aquellas que muestran una morfología similar a la de una neurona piramidal (e). Reducir la dosis viral a un cuarto suprimió la expresión de GFP en células no microgliales en el cerebelo y la corteza cerebral (d, f). Barras de escala; 100 micras. g Gráfico de resumen que muestra la especificidad celular para la microglía en las tres regiones del cerebro. Los números sobre el gráfico representan las dosis relativas de AAV inyectado cuando la dosis inyectada en el cuerpo estriado se toma como 1. Los diagramas de caja y bigotes muestran la mediana (línea central), los percentiles 25 a 75 (recuadro) y los valores mínimo a máximo (bigotes). ) (cuerpo estriado, n = 9 ratones por grupo; cerebelo, n = 7 ratones por grupo, prueba t no pareada de dos colas, t(12) = 3,711, **P ≤ 0,01 para dosis alta frente a dosis baja; corteza cerebral , n = 4 ratones por grupo, prueba t no pareada de dos colas, t(6) = 4,513, **P ≤ 0,01 para dosis alta frente a dosis baja).

En la corteza cerebral, la incubación de tres semanas dio como resultado una transducción extensa de células no microgliales (4,0 ± 1,3 %, 29 microglia en 718 células positivas para GFP, n = 4 ratones; Fig. 3e, g), aunque la corteza cerebral recibió la dosis más baja de AAV. La reducción adicional de la dosis de inyección a un cuarto (de 1,95 × 109 vg/ratón a 0,5 × 109 vg/ratón) aumentó significativamente la especificidad microglial, pero permaneció tan baja como 27,3 ± 3,5 % (369 células en 1316 células positivas para GFP, n = 8 ratones, Fig. 3f, g). Estos resultados sugieren que la microglía en el cuerpo estriado y el cerebelo se puede transducir de manera estable con alta especificidad eligiendo la dosis de inyección óptima; sin embargo, todavía es difícil suprimir la expresión transgénica en células no microgliales en la corteza cerebral.

Estudios anteriores informaron la inducción de la producción de miR-9 después del tratamiento con lipopolisacáridos (LPS) en microglia17 y monocitos15. Si este es el caso, el AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T puede no ser útil en la microglía reactiva activada por LPS. Para validar esta hipótesis, inyectamos AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T en una dosis alta inicial (corteza cerebral, 1,95 × 109 vg/ratón; cuerpo estriado, 3,9 × 109 vg/ratón; cerebelo, 3,9 × 1010 vg/ratón) junto con LPS (0,2 µg/µL) en ratones adultos, seguido de una inyección intraperitoneal de LPS (1 µg/g de peso corporal) todos los días durante una semana (Fig. 4a). Los ratones fueron sacrificados para inmunohistoquímica. Observamos una expresión robusta de GFP en numerosas microglías en las tres regiones del cerebro (Fig. 4b-m). La microglía transducida en ratones tratados con LPS tenía forma ameboidea, con procesos más cortos y gruesos. Estos resultados indican la transducción efectiva de microglia reactiva, así como microglia ramificada, por AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T.

un Diagrama que representa el protocolo experimental. Se inyectó una solución que contenía AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T y LPS (0,2 μg/μL) en las tres regiones del cerebro el día 0, seguido de una inyección intraperitoneal suplementaria de LPS (1 μg/g de peso corporal) diariamente hasta el día 7. Se sacrificaron los ratones 6 h después de la inyección de LPS en el día 7. Se inmunomarcaron cortes de cerebro para GFP e Iba1. b–m Aumento bajo, medio y alto de la corteza cerebral (b–e), cuerpo estriado (f–i) y cerebelo (j–m). Las regiones cuadradas en (b), (f) y (j) se ampliaron a (c), (g) y (k), respectivamente. Barras de escala: 500 μm (b, f, j), 200 μm (c, g, k) y 20 μm (d, e, h, i, l, m). Capa de células granulares GL, lipopolisacárido LPS, capa molecular ML.

La microglía reconoce la estructura específica de LPS a través de TLR4 (receptor tipo Toll 4), lo que conduce a la liberación de citoquinas proinflamatorias, mientras que la microglía en tejidos neurodegenerativos probablemente se estimule a través de receptores depuradores, que inducen la fagocitosis de desechos celulares apoptóticos y la liberación de citocinas antiinflamatorias37. Por lo tanto, la microglía reactiva en tejidos neurodegenerativos puede producir miARN que son distintos de los de la microglía expuesta a LPS. Luego examinamos si AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T se puede usar para la transducción de microglía en tejidos neurodegenerativos. Como modelo neurodegenerativo, elegimos ratones transgénicos (SCA1-Tg) con ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) que expresan ATXN1 anormalmente expandido, específicamente en PC cerebelosas bajo el control del promotor L7 específico de PC (también conocido como la línea B05)38 ,39. Los ratones SCA1-Tg sintomáticos de veinticuatro semanas de edad y sus compañeros de camada de tipo salvaje recibieron inyecciones en el cerebelo de una dosis más baja de AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (1,0 × 1010 vg /ratón; Fig. 5a).

una construcción AAV (AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T) y esquema de la inyección de virus. AAV (dosis: 1,0 × 1010 vg/ratón) se inyectó en el cerebelo de ratón de tipo salvaje y SCA1-Tg a las 24 semanas de edad. Tres semanas después de la inyección viral, se analizaron secciones de cerebelo por inmunohistoquímica. Imagen inmunofluorescente b-d GFP del cerebelo de ratón de tipo salvaje (WT). e–g Imagen inmunofluorescente GFP de una sección sagital del cerebelo de ratón SCA1-Tg (B05). Las regiones cuadradas en b y e se ampliaron a c, d y f, g, respectivamente. Barras de escala; 500 μm (b, e) y 20 μm (c, d, f, g). Capa de células granulares GL, capa molecular ML.

Tres semanas después de la inyección viral, se inmunomarcaron secciones del cerebelo para GFP e Iba1. La microscopía confocal reveló una transducción eficiente y específica de microglia en secciones de ratones SCA1-Tg y sus compañeros de camada de tipo salvaje (Fig. 5b-g). En particular, se transdujo una población mucho mayor de microglia en el cerebelo del ratón SCA1-Tg que en los compañeros de camada de tipo salvaje, al menos en parte debido a la densidad significativamente mayor de microglia en comparación con los ratones de tipo salvaje de la misma edad40. Estos resultados amplían el AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T para dirigirse específicamente a la microglía en tejidos neurodegenerativos.

Para examinar los cambios morfológicos dinámicos en la microglía, se realizaron imágenes GFP vivas confocales en la capa de células granulares de cortes cerebelosos agudos siete a 12 días después de la inyección de AAV (AAV9-Iba1-GFP-miR-9.T-miR-129-2- 3p.T; 3,9 × 1010 vg/ratón) al cerebelo. La mayoría de las células microgliales marcadas con GFP mostraron motilidad morfológica basal, aunque el grado de motilidad varió entre las células (Fig. 6a; Videos complementarios 1–3). En algunas células, la aplicación del baño de ATP (100 μM) indujo un aumento en la motilidad con cierto retraso (Fig. 6b y Videos complementarios 4 y 5). Estos resultados están en consonancia con la dinámica morfológica de la microglía41,42.

a, b Las imágenes fluorescentes GFP de lapso de tiempo (tiempo indicado arriba de las imágenes) que muestran los movimientos basales de los procesos microgliales en a y la regulación positiva de la motilidad inducida por ATP de la microglia en b (fotogramas, cuando se aplicó un baño de ATP 100 µM, se indican como ' +ATP'; 3 min de aplicación de ATP en el panel superior y 1 min en el panel inferior de b). Los paneles superior e inferior en a y b corresponden a ejemplos de diferentes celdas. Barras de escala: 10 µm.

A continuación, examinamos si nuestro método de expresión génica selectiva de microglía podría usarse para medir la señal de Ca2+ de un indicador de calcio fluorescente codificado genéticamente, G-CaMP7.0943. Al menos una semana después de la inyección de AAV (AAV9-Iba1-G-CaMP7.09-miR-9.T-miR-129-2-3p.T; 3,9 × 1010 vg/ratón) en el cerebelo, se obtuvieron imágenes confocales de Ca2+ en vivo. realizado en la capa de células granulares de cortes cerebelosos agudos. Algunas microglías mostraron actividad Ca2+ espontánea (Videos complementarios 6–8; antes de la aplicación de ATP y Fig. 7b; ROI 3 antes de la aplicación de ATP). La aplicación de baño de ATP (100 µM) provocó de manera confiable un aumento de Ca2+ no solo en compartimentos celulares más grandes (Fig. 7a, presumiblemente somas microgliales o procesos microgliales más grandes; Videos complementarios 7 y 8), sino también en compartimentos más pequeños (Fig. 7b, d, presumiblemente procesos finos microgliales; Video complementario 7) de células positivas para G-CaMP. La amplitud máxima media de los cambios de señal de Ca2+ inducidos por ATP (∆F/Fbasal, ver métodos) fue de 3,36 ± 0,19 (Fig. 7c, n = 91 compartimentos celulares de cinco cortes de cerebelo de dos ratones). Estos resultados coinciden con la dinámica microglial típica de Ca2+ porque la microglia expresa receptores purinérgicos y exhibe respuestas de Ca2+ inducidas por ATP del orden de segundos35,44.

a, b Los paneles de la izquierda muestran las imágenes confocales promediadas de las señales G-CaMP expresadas viralmente en la capa de células granulares de cortes cerebelosos agudos. Las regiones de interés (ROI 1–4) se establecieron en compartimentos más grandes (posiblemente somas microgliales o sus procesos más grandes) en a y en compartimentos más pequeños (posiblemente procesos microgliales finos) de la microglia en b. Los paneles de la derecha muestran rastros de cambios en la señal de Ca2+ estimados a partir de la fluorescencia de las regiones de interés ilustradas en los paneles de la izquierda. La aplicación de baño de ATP 100 µM (indicado en barras negras) provocó transitorios de Ca2+ de forma sólida tanto en los compartimentos más grandes como en los más pequeños de la microglía transducida. c Un diagrama de caja y bigotes que muestra señales de Ca2+ cuantificadas inducidas por ATP aplicado en baño (∆F/Fbasal, ver métodos) en los compartimentos celulares microgliales. Los círculos abiertos indican puntos de datos individuales. La línea horizontal y el recuadro representan el valor de la mediana y el rango intercuartílico, respectivamente. Las barras de error indican una desviación estándar por encima y por debajo del valor medio (círculo relleno). d Imágenes fluorescentes de lapso de tiempo que muestran el movimiento de un proceso microglial que expresa G-CaMP7.09 (indicado por un círculo blanco). Tenga en cuenta que los otros compartimentos microgliales positivos para G-CaMP fuera del círculo blanco estaban estáticos.

En conjunto, estos resultados sugieren que las proteínas G-CaMP indicadoras de Ca2+ funcionales se expresan con éxito en la microglía del cerebelo utilizando este método. Por lo tanto, concluimos que nuestro método de expresión génica específica de microglía mediada por AAV también es aplicable a la expresión de un gen que no sea GFP, y que nuestro método puede ser una herramienta poderosa para examinar la dinámica morfológica en vivo en microglía.

Los microARN celulares, incluidos miR-9 y miR-129-2-3p, desempeñan funciones críticas en funciones celulares como la supervivencia celular, la ramificación dendrítica y la plasticidad sináptica45,46,47,48,49. El atrapamiento de miARN endógenos por secuencias de miR.T sobreexpresadas en neuronas y/u otros tipos de células puede afectar las funciones inherentes de los miARN y, en consecuencia, alterar las funciones celulares. Para probar esta posibilidad, el ARNm que contenía miR-9.T y miR-129-2-3p.T se sobreexpresó en todo el cerebro mediante la aplicación sistémica del AAV-PHP.B que penetra la barrera hematoencefálica y expresa GFP-miR- 9.T-miR-129-2-3p.T, utilizando el potente citomegalovirus y el promotor híbrido de β-actina de pollo (CBh)50 (AAV-PHP.B-CBh-GFP-miR.T) o AAV-PHP.B que expresan GFP solo usando el mismo promotor CBh (AAV-PHP.B-CBh-GFP; Fig. 9a complementaria). Dado que el cerebelo expresa niveles más altos de miR-9 y miR-129-2-3p que otras regiones del cerebro, como la corteza cerebral, el tronco encefálico y la médula espinal51, probamos la capacidad de coordinación motora asociada al cerebelo de los ratones tratados usando rotarod y pruebas de caminata de haz tres semanas después de la inyección viral. Los resultados no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos en ninguna de las pruebas de comportamiento (prueba t, n = 5 ratones para cada grupo; Figura complementaria 9b, c).

Después de las pruebas de comportamiento, los ratones fueron sacrificados para el análisis histológico. Los ratones de control mostraron una expresión robusta de GFP tanto en el hígado como en el cerebro (n = 5 ratones, paneles centrales en la Fig. 9d complementaria). En contraste, los ratones que expresaban GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T casi no mostraron expresión de GFP en el cerebro, a pesar de la fuerte expresión de GFP en el hígado (n = 6 ratones; paneles inferiores en la Fig. 9d). Las secciones sagitales del cerebro confirmaron la supresión extensa de la expresión de GFP en todo el cerebro mediante la coexpresión de miR-9.T-miR-129-2-3p.T (panel superior derecho en la Fig. 9e complementaria). Las imágenes ampliadas muestran una expresión débil de GFP en una pequeña cantidad de células, incluidas las células endoteliales vasculares y las PC del cerebelo (paneles central e inferior derecho en la figura complementaria 9e).

Los miARN endógenos unidos a las secuencias diana de miR pueden degradarse junto con los ARNm virales. Para examinar esto, comparamos los niveles endógenos de miR-9, miR-129-2-3p y miR-129-5p (como control) en ratones que expresan GFP-miR-9.T-miR-129-2- 3p.T, y aquellos que expresan GFP solo en tres tejidos cerebrales (corteza cerebral, cuerpo estriado y cerebelo). Los resultados no mostraron diferencias estadísticamente significativas en los niveles de miR-9, miR-129-2-3p y miR-129-5p entre los dos grupos en las tres regiones del cerebro (prueba t, n = 5 ratones por grupo, figura complementaria 9f).

Para verificar la influencia de la sobreexpresión de miR.T en la función neuronal, examinamos las propiedades electrofisiológicas del cerebelo en ratones tratados con AAV-PHP.B que expresan GFP solo o en combinación con miR.T (miR-9.T y miR-129 -2-3p.T).

Los ratones se sacrificaron 3 semanas después de la inyección viral. Con gran aumento de las secciones del cerebelo de ratones que expresan GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T, encontramos que las PC estaban débilmente marcadas con GFP (panel inferior, Fig. 10a complementaria). Esto puede deberse a que la expresión del objetivo de GFP-miR impulsada por el promotor CBh es lo suficientemente fuerte como para exceder la capacidad de silenciamiento génico mediado por miR. En este estudio, examinamos electrofisiológicamente si las PC positivas para GFP-miR.T mostraban anomalías funcionales en comparación con las PC de control que expresaban GFP sola (sin miR.T) bajo el control del mismo promotor (panel superior, Fig. 10a complementaria).

Las propiedades de la membrana eléctrica pasiva de las PC positivas para GFP-miR.T (PC GFP-miRs.T) fueron similares a las de las PC positivas para GFP (PC GFP de control; Fig. 10b complementaria, izquierda, capacitancia de membrana, PC GFP de control, 591,6 ± 45,1 pF, n = 18; PC GFP-miR.T, 655,6 ± 56,5 pF, n = 14, prueba t, P = 0,377; Fig. 10b complementaria, derecha, resistencia de entrada, PC GFP de control, 155,2 ± 38,6 MΩ, n = 18, PC GFP-miR.T, 139,7 ± 24,8 MΩ, n = 14, prueba t, P = 0,755). Examinamos los patrones de disparo espontáneo de los potenciales de acción (picos) en las PC mediante el registro de parches sueltos extracelulares (Fig. 10c complementaria, izquierda), y no hubo diferencia en los intervalos de actividades de picos neuronales espontáneos (es decir, tasa de disparo espontáneo) entre GFP- PC miR.T y PC GFP de control (Fig. 10c complementaria a la derecha, PC GFP de control, 43,1 ± 6,6 ms, n = 20; PC GFP-miR.T, 34,7 ± 5,8 ms, n = 15, prueba t, P = 0,369). Estos resultados sugieren que la expresión excesiva de miR.T no tiene efecto sobre las propiedades de activación intrínsecas de las PC del cerebelo.

También examinamos la transmisión sináptica de fibras paralelas (PF) a PC GFP-miR.T. Las respuestas sinápticas excitatorias basales en las sinapsis PF-PC se caracterizaron mediante el registro de corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC) mediadas por el receptor alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-i ácido (AMPA) en respuesta a diversas intensidades de estímulo aplicadas al PF (Fig. 10d complementaria, izquierda). No hubo una diferencia significativa en la relación intensidad-EPSC amplitud del estímulo entre las PC GFP-miR.T y las PC GFP de control (Fig. 10d complementaria, derecha; pruebas t múltiples corregidas con el método de Holm-Sidak, P > 0.89 en todas las intensidades). La plasticidad sináptica a corto plazo en las sinapsis PF-PC se examinó mediante protocolos de estimulación de pulsos emparejados con intervalos variables (10 ms a 5 s) entre el primer y el segundo pulso (Fig. 10e complementaria, izquierda). La amplitud del segundo PF EPSC evocado por un par de pulsos se normalizó a la del primer PF EPSC, y la relación (es decir, la relación de pulsos emparejados) se trazó frente a los intervalos interestímulo (Figura complementaria 10e, derecha). Tanto las PC GFP-miR.T como las PC GFP de control mostraron una facilitación sináptica similar a intervalos más cortos (Fig. 10e complementaria), lo cual es típico de las sinapsis52 de PF-PC, y no hubo diferencia estadística en las relaciones de pulso emparejado entre GFP-miR . PC T y PC GFP de control (ANOVA bidireccional de medidas repetidas, efecto miR, P = 0,35). Estos resultados sugieren que la sobreexpresión de miR.T no influye en la transmisión sináptica basal ni en la plasticidad sináptica a corto plazo en las sinapsis PF-PC.

A continuación, examinamos si la aplicación sistémica de AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T transdujo con éxito la microglía en el cerebro. Los ratones de tipo salvaje (WT) y SCA1-Tg a las 36 semanas de edad recibieron una infusión intravenosa de AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (1,5 × 1012 vg/ ratón) y se sacrificaron 3 semanas después de la inyección para inmunohistoquímica (Fig. 8a). La microscopía confocal mostró puntos GFP dispersos por todo el cerebro, incluidos el cerebelo y los núcleos pontinos (ratones WT y SCA1-Tg, Fig. 8b y Fig. 11 complementaria).

Los ratones SCA1-Tg a las 36 semanas de edad recibieron una infusión intravenosa de AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (dosis: 1,5 × 1012 vg/ratón). Tres semanas después de la inyección viral, se produjeron secciones de cerebro y se analizaron mediante inmunomarcaje doble para GFP e Iba1. (bd) Imágenes inmunofluorescentes de una sección sagital (lóbulos II y III) del ratón SCA1-Tg (b) y la ampliación de regiones cuadradas (c, d). Tenga en cuenta la agregación de GFP en microglia en el cerebelo de ratón SCA1-Tg. Barras de escala, 20 μm. GL; capa de células granulares, iv; inyección intravenosa, ML; capa molecular, SCA1-Tg; ataxia espinocerebelosa tipo 1-transgénica.

Con mayor aumento, encontramos que los puntos GFP estaban ubicados en microglía inmunomarcada con Iba1 (Fig. 8c, d y Fig. 11d, e, g, h complementarias). Especulamos que este era el proceso de degradación lisosomal de la proteína GFP en microglia. Para verificar esto, se inmunomarcaron secciones del cerebelo para GFP, Iba1, ADN nuclear (usando tinción de Hoechst) y proteína de membrana 1 asociada a lisosomas (LAMP1), una glicoproteína ubicada a través de las membranas lisosómicas53. Como se suponía, los agregados de GFP se co-localizaron con precisión con la inmunorreactividad de LAMP1 (Fig. 12 complementaria), lo que indica que los agregados de GFP estaban presentes en los lisosomas microgliales. Estos resultados sugieren que la administración intravenosa de AAV-PHP.B.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T provoca la expresión de GFP específicamente en la microglía. Sin embargo, a diferencia de la inyección directa de tejido cerebral, GFP se clasifica en una vía digestiva lisosomal.

Tuvimos éxito en la transducción específica de microglía en distintas regiones del cerebro de ratones adultos mediante la inyección parenquimatosa cerebral directa de vectores AAV que llevan el promotor Iba1 de ratón de 1,7 kb y dos conjuntos de copias de secuencias en tándem de 4, cada una de las cuales es complementaria a diferentes miRNAs, miR -9 y miR-129-2-3p.

La presencia o ausencia y el nivel de expresión de genes endógenos están estrictamente regulados de una manera específica del tipo de célula y dependiente de la etapa de desarrollo. Por el contrario, la expresión del transgén mediada por AAV que utiliza un promotor específico del tipo de célula está menos influenciada por esta regulación biológica debido a la incorporación insuficiente del promotor específico del tipo de célula, que abarca solo una región limitada del genoma, y ​​la posible aplicación de sobredosis, lo que lleva a la expresión transgénica ectópica. en tipos celulares no deseados. En este contexto, la inyección de una dosis óptima de AAV que lleva un promotor con alta especificidad para la microglía es crucial para la orientación microglial. En nuestras condiciones experimentales (Fig. 1b, f), el presente promotor Iba1 de ratón de 1.7 kb funcionó preferentemente en microglia en el estriado (~ 69%) y cerebelo (~ 86%), mientras que casi no mostró especificidad para microglia en el corteza cerebral (~ 2%), independientemente de la aplicación de la dosis más baja (Tabla 1 y Fig. 3 complementaria), lo que sugiere heterogeneidad de los tejidos cerebrales y especificidad de la región del promotor Iba1 de 1.7 kb. Otro inconveniente del uso de vectores virales es la limitada capacidad de empaquetamiento, especialmente en AAV; el tamaño relativamente largo del promotor Iba1 (1,7 kb) restringe el tamaño del transgén a un máximo de ~2 kb.

Aunque aprovechamos el promotor Iba1 para la expresión del transgén dirigido a la microglía, cabe señalar que el promotor Iba1 es precisamente un promotor específico de células mieloides y funciona en macrófagos residentes del SNC, incluidos los macrófagos meníngeos, perivasculares y del plexo coroideo; células dendríticas; e infiltrar monocitos en condiciones patológicas. Por lo tanto, una población sutil de células transducidas con AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T puede incluir estos tipos de células.

Los microARN guían las proteínas Argonaute (AGO) y forman el módulo de orientación del complejo de silenciamiento inducido por miARN (miRISC), que causa la represión traduccional y la degradación de los ARNm específicos54. Se demostró que tanto miR-9 como miR-129-2-3p estaban enriquecidos en células no microgliales, pero estaban específicamente disminuidos en microglia22. Por lo tanto, los ARNm que llevan las secuencias diana son absorbidos por miRISC que contienen miR-9 o miR-129-2-3p, lo que conduce al silenciamiento selectivo de la expresión transgénica en células no microgliales. Una preocupación es la degradación simultánea de los miARN y su agotamiento en células no microgliales, incluidas las neuronas. Sin embargo, los niveles endógenos de miR-9 y miR-129-2-3p en las tres regiones del cerebro no cambiaron significativamente, incluso después de la sobreexpresión de GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T usando un fuerte y promotor ubicuo de CBh (Fig. 9f complementaria), aunque la expresión de GFP se suprimió drásticamente (Fig. 9d, e complementaria). Este resultado es consistente con un informe reciente55 que muestra que los objetivos completamente complementarios (como en nuestro caso presente) se escinden cuando se unen a un AGO catalítico, como el Ago2 de mamífero, pero el emparejamiento del ARNm objetivo con AGO da como resultado la descarga del miARN. de AGO y reciclaje del miRNA. De acuerdo con esto, la capacidad motora y los análisis de pinzamiento del parche del cerebelo no se alteraron significativamente en los ratones que expresaban GFP-miR-9.T-miR-129-2-3p.T en todo el cerebro (Figuras complementarias 9 y 10) . Sin embargo, no se puede excluir el deterioro de la función neuronal en otras regiones del cerebro y la asociación con defectos de comportamiento tras la sobreexpresión de miR-9.T y miR-129-2-3p.T.

A diferencia de miR-129-2-3p.T, la adición de miR-136-5p.T a AAV9.Iba1.miR-9.T no logró suprimir la expresión transgénica en células no microgliales, a pesar de la expresión de miR-136 -5p en neuronas21. Un estudio anterior demostró que las células dendríticas inmaduras que expresaban niveles bajos de miR-155 no suprimían la expresión de un transgén que portaba miR-155T, mientras que las células dendríticas maduras que aumentaban los niveles de miR-155 inducían una sorprendente supresión del objetivo32, lo que sugiere que la regulación negativa del objetivo ocurre en un cierto umbral de expresión de miARN. Esta idea está respaldada por un informe reciente que reveló que los niveles de expresión de miR-136-5p en la corteza cerebral eran mucho más bajos que los de miR-129-2-3p (y miR-9)51. Por lo tanto, es probable que los niveles de expresión de miR-136-5p en células no microgliales estén por debajo del umbral para la degradación del ARNm diana.

Además de la microglia ramificada en tejidos sanos, los vectores AAV transdujeron microglia reactiva en los cerebros de ratones tratados con LPS y SCA1-Tg. Esto podría ser ventajoso porque nuestro método se puede aplicar a experimentos patológicos y preclínicos dirigidos a la neuroinflamación y la neurodegeneración, como se describió anteriormente en modelos de ratones con enfermedad de Parkinson56. Además, el AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T podría usarse para estudios funcionales de microglia, como lo demuestra el monitoreo basado en G-CaMP7.09 de la movilización de Ca2+ intracelular (Fig. 7).

La aplicación intravenosa de AAV-PHP.B dirigido a microglía dio como resultado la expresión de GFP específica de microglía. Sin embargo, inesperadamente, la GFP expresada se transfirió a la ruta de degradación lisosomal. Dado que la microglía juega un papel en la lucha contra los virus que ingresan desde la circulación periférica al cerebro, la cápside del AAV puede sufrir alguna modificación, como la adición o escisión de la glicosilación, al cruzar la BBB para sensibilizar a la microglía residente. Este resultado es decepcionante para nosotros, pero podría ser un éxito parcial en la administración intravenosa de un producto transgénico específicamente para la microglía. Además, explorar el mecanismo subyacente a la activación microglial por el AAV cruzado por BBB (pero no por el AAV inyectado directamente en los tejidos cerebrales) puede conducir a la identificación de una interacción clave (o molécula) que sensibilice a la microglia residente, lo que probablemente facilite el desarrollo de un mutante. cápside que no sensibiliza la microglía.

En conjunto, nuestros resultados validaron la eficacia de la inyección cerebral directa de AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T para la transducción de microglía reactiva en un entorno patológico, así como microglía ramificada en cerebros sanos. . Aunque la microglía dirigida a la corteza cerebral requiere un ajuste cuidadoso de la dosis de administración y el período de incubación, el AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T sería útil para la investigación básica y los estudios preclínicos y también puede ser prometedor en estudios clínicos dirigidos a la microglía, ya que las secuencias de miR-9 y miR-129-2-3p se comparten ampliamente desde roedores hasta primates, incluido el Homo sapiens.

Durante la preparación de este manuscrito, se informaron variantes de la cápside de AAV con alta afinidad por la microglía; sin embargo, no fueron específicos de microglia57. La combinación de estas cápsides mutantes microglia-trópicas con nuestro Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T dirigido a microglia puede ayudar a reducir sustancialmente la dosis de aplicación y lograr una mayor orientación microglial en la corteza cerebral.

Las secuencias diana se diseñaron en función de las secuencias de miARN obtenidas del Registro de miARN (www.mirbase.org). Los oligonucleótidos utilizados para construir miR.T se presentan en la Tabla complementaria 1. Para el vector PGK.miR-9.T, el correspondiente sentido 1 (S1), sentido 2 (S2), antisentido 1 (AS1) y antisentido 2 ( Los oligonucleótidos AS2) se hibridaron y ligaron en los sitios de restricción KpnI y BamHI en el 3'-UTR del casete de expresión transgénica del vector original AAV.PGK. Para los vectores PGK.miR-9.T.miR-129-2-3p.T o PGK.miR-9.T.miR-136-5p.T y S1, S2, S3, S4, AS1, AS2, AS3 , y los oligonucleótidos AS4 se hibridaron y ligaron en los sitios de restricción KpnI y BamHI en la 3'-UTR del casete de expresión de GFP del vector original AAV.PGK.

Utilizamos un fragmento de 1678 pb de la región flanqueante 5' del primer ATG en el exón 1 del gen Iba1 (Aif1) de ratón. Para clonar el promotor Iba1, se realizó una PCR anidada utilizando el ADN genómico derivado de células cerebrales de ratón. Los conjuntos de cebadores Iba1-Nest-F (5′-CCTAGAGCCATCTTGTAAGG-3′) e Iba1-Nest-R (5′-CGAGGAATTGCTGTTGAG-3′) se utilizaron para la primera amplificación de ADN e Iba1-F (5′-ATGCTCTAGActcgagTACTATAGGATGCATCGTGAAAACC- 3′) e Iba1-R (5′-CATGGTGGCGaccggtGGCTCCTCAGACGCTGGTTG-3′) para el segundo.

Para la construcción de Iba1, Iba1.miR-9.T, Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T (Addgene ID: 190163) o Iba1.miR-9.T.miR-136 -5p.T, el promotor PGK en los vectores AAV.PGK parentales correspondientes se reemplazó con el promotor Iba1 de 1,7 kb de ratón en los sitios de restricción XhoI y AgeI.

Los vectores AAV2/9 y AAV-PHP.B se produjeron por cotransfección de células HEK293T (HCL4517; Thermo Fisher Scientific, Tokio, Japón) con tres plásmidos: el plásmido de expresión, pHelper (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.), y pAAV9. Las partículas virales se purificaron usando precipitación con sulfato de amonio o polietilenglicol 8000 y centrifugación en gradiente continuo con yodixanol como se describió previamente58. Los títulos genómicos de los vectores AAV purificados se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando Power SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher) con los cebadores 5′-CTGTTGGGCACTGACAATTC-3′ y 5′-GAAGGGACGTAGCAGAAGGA-3′ dirigidos a la secuencia WPRE. Se usaron vectores de plásmidos de expresión como estándares. El título de expresión del vector concentrado osciló entre 6,92 × 1012 y 6,30 × 1013 vg/mL.

En este estudio se utilizaron ratones C57BL/6J (de 4 a 8 semanas de edad), ratones FVB/N-Tg (Pcp2-ATXN1*82Q) 5Horr y sus compañeros de camada de tipo salvaje (de 24 a 36 semanas de edad). En todos los experimentos, se prestó especial atención al sexo de los ratones para evitar sesgos hacia machos o hembras. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Ley japonesa sobre el bienestar y el manejo de los animales y las Directrices para la realización adecuada de experimentos con animales, emitidas por el Consejo de Ciencias de Japón. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité Institucional de la Universidad de Gunma (Nos. 21-063 y 21-065). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento y reducir el número de animales utilizados.

Se realizaron inyecciones estereotáxicas de vectores AAV en ratones C57BL/6J de 4 semanas de edad, ratones FVB/N-Tg sintomáticos de 24 semanas de edad y sus compañeros de camada de tipo salvaje. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg de peso corporal [BW]) y xilazina (10 mg/kg BW), respectivamente. La profundidad de la anestesia se controló mediante el reflejo de pellizco del dedo del pie durante toda la cirugía, y se inyectaron ketamina y xilazina adicionales cuando fue necesario. Se creó un agujero de trepanación sobre el sitio de la inyección para exponer el cerebro. Un vector AAV (AAV9.PGK.miR-9.T, AAV9.Iba1, AAV9.Iba1.miR-9.T, AAV9.Iba1.miR-9.T.miR-129-2-3p.T, o AAV9 .Iba1.miR-9.T.miR-136-5p.T) se inyectó en la corteza cerebral, cuerpo estriado y cerebelo de ratones. Para reducir el volumen de inoculación y aumentar la precisión, se utilizó una jeringa Hamilton de 10 μL con una aguja de 33 G para las inyecciones. Se utilizaron las siguientes coordenadas estereotáxicas para la inyección viral: corteza cerebral, AP −1,0 mm, ML +1,5 mm, DV +0,9 mm; cuerpo estriado, AP −1,0 mm, ML +1,75 mm, DV +2,75 mm; cerebelo, AP +6,5 mm, ML 0 mm, DV 2,0 mm (todos los valores son relativos al bregma). La cantidad total de solución de AAV fue la siguiente: corteza cerebral, 1,95 × 109 vg/ratón; cuerpo estriado, 3,9 × 109 vg/ratón; cerebelo, 3,9 × 1010 vg/ratón para inyección de dosis alta; corteza cerebral, 5,0 × 108 vg/ratón; cerebelo, 1,0 × 1010 vg/ratón para inyección de dosis baja. Las velocidades de aplicación fueron las siguientes: corteza cerebral, 10 nL/min; cuerpo estriado, 20 nL/min; y cerebelo, 200 nL/min.

La inyección intravenosa de AAV-PHP.B se llevó a cabo en ratones FVB/N-Tg sintomáticos de 36 semanas de edad y sus compañeros de camada de tipo salvaje. Después de la anestesia profunda, se inyectaron por vía intravenosa 100 μL de solución AAV-PHP.B (1,5 × 1013 vg/mL) en el seno retroorbitario de los ratones usando una jeringa de 0,5 ml con una aguja de calibre 30 (08277; Nipro, Osaka, Japón).

Los ratones se perfundieron transcardiacamente con paraformaldehído al 4% en PB 0,1 M (pH 7,4), el cerebro se fijó posteriormente durante 6 a 8 h y se transfirió a 1x PBS. Los cerebros se cortaron en cortes coronales de 50 µm para la corteza cerebral, cuerpo estriado y cortes sagitales del cerebelo usando un micrótomo (VT1000S o VT1200S; Leica, Wetzlar, Alemania). Los cortes se trataron con una solución de bloqueo (suero de burro normal al 5 %, Triton X-100 al 0,5 % y NaN3 al 0,05 % en PBS) durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios resumidos en la Tabla complementaria 2. Después del lavado con PBS tres veces durante 15 min cada uno, las rebanadas se incubaron de 2 h a toda la noche a 4 ° C con los anticuerpos secundarios resumidos en la Tabla complementaria 2. Finalmente, las rebanadas se enjuagaron en PBS tres veces, se incubaron con tinción de ácido nucleico Hoechst 33342 (Invitrogen número de catálogo H1399), lavado en ddH2O, montado en ProLong Diamond/Glass Antifade Mountant (Thermo Fisher) y almacenado a 4 °C en la oscuridad. La inmunofluorescencia se analizó utilizando un microscopio confocal de escaneo láser Zeiss LSM 800 y el software que lo acompaña (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).

La proporción de células mieloides cerebrales transducidas con vectores AAV se examinó mediante inmunohistoquímica. Las secciones de tejido de 50 μm de espesor obtenidas de la corteza cerebral, el cuerpo estriado y el cerebelo se inmunoteñeron para GFP e Iba1. Treinta secciones ópticas consecutivas a intervalos de 0,5 μm (25.513,67 μm2, profundidad total de 15 μm) se capturaron utilizando un microscopio Zeiss LSM 800 con un objetivo 40x/0,95 NA y las imágenes se procesaron posteriormente con el software Zeiss Zen para crear una proyección de máxima intensidad ( MIP) imagen. De cada corte de cerebro, se adquirieron 32 imágenes MIP sin superposición (total 816.386,42 μm2) y se contó el número de células mieloides que expresan GFP. Las células positivas para GFP comarcadas con Iba1 se consideraron células mieloides cerebrales. Se analizaron tres cortes de cerebro por ratón y de 4 a 9 ratones. Se contaron un mínimo de 500 células.

Las imágenes confocales de Ca2+ o GFP de cortes cerebelosos agudos se realizaron como se describió anteriormente27,39, con algunas modificaciones. Se prepararon cortes parasagitales (200-250 µm de espesor) del vermis cerebeloso usando un vibroslicer (VT1200S; Leica, Alemania) y se mantuvieron en una solución (ACSF) que contenía (en mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1, 0 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3 y 20 d-glucosa, y se burbujearon con 95 % O2 y 5 % CO2 a temperatura ambiente durante más de 1 hora antes del comienzo de los registros. El procesamiento y análisis de imágenes se realizaron con Andor iQ2 (Andor), NIH ImageJ, Igor Pro8 (WaveMetrics) y programas personalizados de NH.

G-CaMP7.09 es un indicador de Ca2+ codificado por genes desarrollado recientemente que aumenta su fluorescencia cuando la concentración de Ca2+ intracelular es elevada43. Para registrar las señales de Ca2+ de las células que expresan G-CaMP7.09, se adquirieron imágenes de fluorescencia confocal cada 2 s (tiempo de exposición de 200 a 300 ms, 512 × 512 píxeles, sin binning) con un objetivo de inmersión en agua de ×40 (LUMPLFLN 40XW; Olympus , Tokio, Japón), una cámara CCD refrigerada por agua (iXon3 DU-897E-CS0-#BV-500; Andor, Belfast, Irlanda del Norte) y una unidad confocal de disco giratorio de alta velocidad (CSU-X1; Yokogawa Electric , Tokio, Japón) conectado a un microscopio vertical (BX51WI; Olympus, Tokio, Japón). Se usó un haz de luz de 488 nm de un módulo de láser de diodo (Stradus 488-50; VORTRAN, Sacramento, CA) para la excitación, y la fluorescencia emitida se recolectó a través de un filtro de paso de banda (500–550 nm). Durante las grabaciones, los cortes de cerebelo se perfundieron con una solución de baño ACSF a temperatura ambiente.

Para provocar un aumento de Ca2+ intracelular en la microglía, se aplicó extracelularmente ATP 100 µM disuelto en la solución de baño ACSF a través de un dispositivo de aplicación de baño alimentado por gravedad44.

Debido a que las grabaciones continuas únicas duraron más de 10 minutos, ocasionalmente se observó una desviación de la imagen (desviación de la traducción). En estos casos, las imágenes desviadas se corrigieron utilizando el complemento Image Stabilizer en ImageJ (http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html). Se restó el fondo de la fluorescencia de G-CaMP en el tiempo t (Ft) en cada píxel, y se midió el aumento relativo de la fluorescencia dependiente de Ca2+ calculando ΔF/Fbasal, donde Fbasal es la intensidad de fluorescencia basal promediada durante los marcos previos al estímulo (es decir, , tramas antes de la aplicación ATP), y ΔF = Ft−Fbasal. La fluorescencia de fondo se obtuvo de una región que carecía de la estructura celular en el mismo marco. Los valores medios de ΔF/Fbasal en cada región de interés (ROI) se calcularon para cada cuadro. Los ROI se colocaron en estructuras celulares positivas para G-CaMP. No pudimos determinar si múltiples ROI adyacentes en un cuadro estaban en la misma celda o en otras celdas diferentes; por lo tanto, nos referimos a un solo ROI como un compartimento celular microglial. Por lo general, la cobertura del territorio de un proceso microglial alcanza unos pocos cientos de micrómetros42, y los datos de imágenes de Ca2+ en este estudio se recolectaron de 12 campos de visión diferentes, separados por más de 300 µm, en cinco cortes de dos ratones. Por lo tanto, podemos decir con seguridad que nuestro conjunto de datos de imágenes de Ca2+ provino de más de 12 microglia. Para cuantificar las señales de Ca2+ inducidas por ATP en células positivas para G-CaMP, se midió la amplitud máxima de ΔF/Fbasal en una ventana de tiempo de 120 s después del inicio de la aplicación de ATP.

Para registrar la dinámica morfológica en vivo en células positivas para GFP, se adquirieron imágenes de fluorescencia GFP confocal cada 2–6 s (exposición de 200-250 ms, 512 × 512 píxeles, sin binning). La relación señal-ruido de las señales GFP fue mucho mayor que la de las señales G-CaMP en nuestras condiciones experimentales. La desviación de la imagen en las imágenes de GFP se corrigió de manera comparable a la de las imágenes de Ca2+.

Para examinar si el fenotipo conductual se vio afectado por la sobreexpresión de secuencias diana de miARN, se inyectó por vía intravenosa AAV-PHP.B.CBh-GFP (PHP.B.CBh-GFP) a ratones C57BL/6J de 6 a 7 semanas de edad. o AAV-PHP.B.CBh-GFP-miR-9.T.miR-129-2-3p.T (PHP.B.CBh-GFP-miR.T), respectivamente a un título de 6 × 1011 vg. Tres semanas más tarde, se evaluó el rendimiento motor utilizando la prueba rotarod en una cinta rodante (MK-610A/RKZ; Muromachi Kikai, Tokio, Japón). Los ratones fueron sometidos a tres ensayos a intervalos de 30 min. Se aceleró la velocidad de rotación de 4 a 50 rpm en 300 s, y se midió el tiempo que tardó en desprenderse la varilla. Después de la prueba del rotarod, los ratones se sometieron a más pruebas utilizando una prueba de caminata con haz. Después de la habituación, los ratones se colocaron en el borde de una barra (600 mm de largo y 11 mm de diámetro) y caminaron sobre la barra tres veces. El rendimiento de los ratones que caminaban sobre la viga se registró usando una cámara de video digital (velocidad de obturación: 1/500, 60 fps; HC-VX985M; Panasonic, Osaka, Japón) y el tiempo promedio que los ratones tardaron en caminar a través de una 600- Se midió un haz de mm de largo.

Para medir el número de miARN endógenos, se inyectaron por vía intravenosa PHP.B.CBh-GFP o PHP.B.CBh-GFP-miR a ratones C57BL/6J de 8 semanas de edad. T, a un título de 6 × 1011 vg/ratón. Tres semanas después de la inyección, los ratones fueron profundamente anestesiados y perfundidos con PBS frío (-). Luego, los cerebros se extrajeron rápidamente y se dividieron en dos partes, con el eje izquierdo-derecho a lo largo de la línea media. El cerebro izquierdo (para la observación histológica) se sumergió en paraformaldehído (PFA) frío al 4 % durante la noche a 4 °C y se reemplazó con PFA al 4 % con 1 × PBS (-) al día siguiente. Luego se produjeron secciones sagitales (50 μm de espesor) usando un micrótomo VT1200S (Leica). Los cortes se inmunoteñeron con fluorescencia con anticuerpos anti-GFP (04404-84; Nacalai Tesque) y anti-NeuN (MAB377; Merck) y se montaron con ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific). Se obtuvieron fotomicrografías de secciones inmunoteñidas usando un microscopio de fluorescencia BZ-X800 (Keyence). La mitad derecha del cerebro se utilizó para medir los niveles de miARN. Los lóbulos parietales de la corteza cerebral, el cerebelo y el cuerpo estriado se recolectaron y colocaron por separado utilizando el reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific). El tejido se homogeneizó utilizando BioMasher II (320103; Nippi, Tokio, Japón) y Power Masher II (891300; Nippi) y se inactivó rápidamente con nitrógeno líquido. Los tejidos se almacenaron a -80 °C hasta que se recolectó el ARN. Se usó el mini kit miRNeasy (217004; QIAGEN, Hilden, Alemania) para recolectar los ARN totales que contenían los miARN. El ARN total se transcribió de forma inversa utilizando el kit de transcripción inversa de microARN TaqMan (4366596; Thermo Fisher Scientific) y cebadores de transcripción inversa específicos de miARN (ID de ensayo: 000583; 4427975; Thermo Fisher Scientific). Las cantidades de miR-9, miR-129-2-3p y miR-129-5p en las muestras de miARN con transcripción inversa se cuantificaron utilizando una sonda TaqMan (ID de ensayo: 000583; 4427975; Thermo Fisher Scientific) y TaqMan Fast Advanced Master Mix (4444556; Thermo Fisher Scientific) en un termociclador para PCR en tiempo real (Thermal Cycler Dice Real-Time System II, Takara Bio, Kusatsu, Japón).

Se prepararon cortes cerebelosos agudos y se mantuvieron como se describe en la sección Métodos sobre "Imagen en vivo confocal" a continuación. Los registros de patch-clamp de células completas se realizaron usando un amplificador MultiClamp 700 B (Molecular Devices, EE. UU.) en modo de voltaje-clamp (potencial de retención de -70 mV) a temperatura ambiente a partir de los somas de las PC del cerebelo usando pipetas patch (1–4 MΩ) extraído de vidrio de borosilicato (Harvard Apparatus) o vidrio #0010 (PG10165-4, World Precision Instruments). La solución de pipeta contenía (135 mM) 135 K-gluconato, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 5 mM NaCl, 5 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, 0,1 mM EGTA y 5 mM fosfocreatina (pH 7,3). El potencial de la unión líquida no se corrige. Las propiedades de la membrana eléctrica pasiva de las PC registradas se estimaron utilizando las trazas promediadas de 20 respuestas de corriente evocadas por pulsos de voltaje hiperpolarizantes (de −70 a −75 mV, 500 ms de duración) en el modo de sujeción de voltaje. Para registrar los EPSC provocados por fibras paralelas (PF), la solución extracelular ACSF (consulte la sección "Imagen en vivo confocal" a continuación) se complementó con picrotoxina (100 µM) para bloquear las corrientes sinápticas inhibidoras mediadas por el receptor GABAA, y los PF se estimularon aplicando cuadrados pulsos (60 µs, 10–60 µA) a través de una pipeta de vidrio llena con la solución extracelular y colocada en la capa molecular del corte cerebeloso. Para el registro de parches sueltos extracelulares, las pipetas de parche se llenaron con solución extracelular y se colocaron cerca de los somatas de las PC positivas para GFP (adheridas a células sueltas). Las corrientes de acción espontáneas (generadas por activación neuronal espontánea) se registraron utilizando un amplificador EPC-8 (HEKA Elektronik GmbH, Alemania) durante al menos 1 min a un potencial de pipeta de 0 mV. La aparición de picos se detectó mediante el umbral de nivel actual. Cuando las formas de onda de las corrientes de acción detectadas no eran uniformes, los datos se descartaban. Se midieron los intervalos entre picos de todos los eventos detectados en cada PC, y se tomó un promedio de los intervalos como valor representativo de cada PC registrado. Todos los datos electrofisiológicos se adquirieron con el software pCLAMP10 (Molecular Devices) y se analizaron con Igor Pro 8 (Wavemetrics) con Neuromatic (http://www.neuromatic.thinkrandom.com/)59 y procedimientos Igor personalizados por NH.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corp., Armonk, NY) y GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Se verificó el cumplimiento de todos los datos con los supuestos estadísticos para cada prueba, incluida la distribución normal y las varianzas iguales entre los grupos. A menos que se indique lo contrario, los datos se presentan como media ± SEM y se usaron pruebas t no pareadas de dos colas o pruebas de comparación múltiple ANOVA para evaluar la significancia estadística. Los datos cuantitativos de especificidad microglial en el cerebelo una semana después de la inyección viral se analizaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis porque no se confirmó la normalidad de los datos, y se usó una prueba de Dunn post hoc con ajuste de Bonferroni para comparaciones múltiples para determinar la significancia estadística (Tabla 1 ). Los datos electrofisiológicos de la amplitud de PF EPSC y la relación de pulsos emparejados se analizaron utilizando múltiples pruebas t corregidas con el método de Holm-Sidak y ANOVA de medidas repetidas bidireccionales, respectivamente (Fig. 10d, e complementarias). La significación estadística se consideró en P < 0,05 (o equivalente corregido para comparaciones múltiples). No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, pero nuestros tamaños de muestra fueron similares a los informados en estudios previos. En los gráficos para experimentos electrofisiológicos, los gráficos de barras que representan los valores medios y los puntos de datos individuales se muestran en paralelo. En los diagramas de caja, las líneas centrales, los enlaces de la caja y los bigotes representan la mediana, los percentiles 25/75 y los valores mínimo/máximo, respectivamente. Más detalles del análisis estadístico se informan en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

El plásmido que contiene el promotor Iba1 y dos tipos de miR.T utilizados en este estudio están disponibles en Addgene (Addgene ID: 190163). Los cambios morfológicos microgliales asociados con este estudio están presentes en el artículo y en las películas complementarias. Los datos de origen para cada gráfico relacionado se proporcionan en el archivo de datos complementarios 1. Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente HH previa solicitud razonable.

Todos los códigos de análisis escritos a medida están disponibles del autor correspondiente a pedido.

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Los autores agradecen a Asako Ohnishi, Nobue McCullough y Ayako Sugimoto por la producción de los vectores AAV, Junko Sugiyama por criar ratones y Junko Sugi por algunos experimentos con ratones. Esta investigación fue financiada parcialmente por el programa Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) con los números de subvención JP19dm0207057, JP20dm0207057, JP21dm0207111 y JSPS KAKENHI (números de subvención 15H04254 , 16K15477, 18H02521, 15K18330, 19K06899 y 22K06454).

Departamento de Neurofisiología y Reparación Neural, Facultad de Medicina de la Universidad de Gunma, Maebashi, Gunma, 371-8511, Japón

Yukihiro Okada, Nobutake Hosoi, Yasunori Matsuzaki, Yuuki Fukai, Akito Hiraga, Keisuke Nitta, Yoichiro Shinohara, Ayumu Konno y Hirokazu Hirai

División de Fisiología Oral, Odontología para el Manejo de Enfermedades, Facultad de Odontología de la Universidad de Tohoku, Sendai, 980-8575, Japón

Junichi Nakai

Núcleo de vectores virales, Universidad de Gunma, Iniciativa para la investigación avanzada, Maebashi, Gunma, 371-8511, Japón

Ayumu Konno y Hirokazu Hirai

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YO, AK y HH diseñaron los experimentos; YO, KN, YS, YM, YF, AH, NH y AK realizaron la investigación; NH realizó los experimentos de imágenes de Ca2+; JN proporcionó el material experimental; YO redactó y HH completó el estudio.

Correspondencia a Hirokazu Hirai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Guochun Jiang, Negin Martin y Sandra Siegert por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Eliana Scemes, Veronique van den Berghe y Christina Karlsson Rosenthal. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Okada, Y., Hosoi, N., Matsuzaki, Y. et al. Desarrollo de vectores virales adenoasociados dirigidos a microglia como herramientas para estudiar el comportamiento microglial in vivo. Commun Biol 5, 1224 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04200-3

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Recibido: 04 julio 2022

Aceptado: 31 de octubre de 2022

Publicado: 11 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04200-3

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